マイコプラズマ・ニューモニエの特異的検出のための抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(英語)

サマリー

マイコプラズマ・ニューモニエ感染症では、血清学的検査は良好な結果を生み出すことができますが、免疫学的交差反応のために特異性は低くなります。この論文に記載されている社内抗原捕捉ELISAは、高い種特異性を保証し、肺炎球菌の正確な診断のための信頼できるスクリーニング検査であることが示されています。

要約

マイコプラズマ・ニューモニエ は細胞壁欠損原核生物であり、主にヒトの気道にコロニーを形成し、流行していることが知られており、年長の子供や若年成人では6年ごとに流行のピークがあります。 M.肺炎 の診断は、病原体の潔癖な性質と無症候性の運搬の可能性があるため、困難です。患者の血清サンプル中の抗体滴定に基づく 肺炎 菌感染症の臨床検査は、依然として最も実践されている方法である。 M. pneumoniaeに対するポリクローナル血清の使用による免疫学的交差反応性の潜在的な問題のために、血清学的診断の特異性を改善するために抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が開発されました。ELISAプレートは、 M. pneumoniae ポリクローナル抗体でコーティングされ、ウサギで飼育され、 M. pneumoniae 種と抗原を共有する、および/または気道にコロニーを形成することが知られている異種細菌のパネルに対する吸着後に特異的になります。反応した M. pneumoniae 相同抗原は、次いで、血清サンプル中のそれらの対応する抗体によって特異的に認識される。抗原捕捉ELISAが受ける物理化学的パラメータのさらなる最適化は、非常に特異的で、感度が高く、再現性の高いELISAにつながりました。

概要

マイコプラズマは 、最も小さく、最も単純な既知の原核生物の一つです。それらは主に細胞壁構造の欠如によって他の細菌と区別される。したがって、 マイコプラズマは モリキューテス¹という名前の別のクラスに分類されました。細胞壁欠損症は、いくつかの抗菌剤に対してこれらの微生物に対する固有の耐性を与え、それらの多型の主な原因です。 マイコプラズマは ゲノムが小さく、サイズが小さく、代謝および生合成能力が制限され、寄生および腐生の性質を説明しています¹。

マイコプラズマ・ニューモニエは、人間に感染するマイコプラズマの1つであり、最も毒性が高いと考えられています²。M.肺炎は上気道にコロニーを形成し、小児および若年成人に非定型肺炎を引き起こします。肺炎球菌感染によって引き起こされる臨床徴候はインフルエンザのようなもので、頭痛、発熱、咳³があります。宿主細胞に対するM. pneumoniaeの細胞付着は、P1主要な接着およびいくつかの付属品タンパク質を含む付着オルガネラによって媒介される^4,5....

プロトコル

本研究は、チュニスパスツール研究所の倫理委員会によって確立された倫理的側面に準拠して実施された。

1. ELISA前のステップ:前提条件と前処理

1. 細菌株および増殖培地
   注:本研究で使用されたモリキューテス種と壁に囲まれた細菌、およびそれらの増殖培地を 表1に示します。
   1. モリキューテス種の成長
      1. 各種のグリセロールストックから200 μLを1,800 μLの培地に接種します。
      2. pH変化が観察されるまで、5%CO₂ で37°Cで2〜4日間静的にモリキューテス種を成長させます(pHインジケーターはフェノールレッドです)。
      3. 培養物の1/10^倍 希釈液を培地に加え、培養液を10 mLにスケールアップし、同じ条件で再び増殖させます。
         注:代謝によると、一部のヒトモリキューテス種(M.ニューモニエ、M. ジェニタリウム、およびM. ファーメンタン)はグルコース発酵により培地を酸性化し、他の種(M.ホミニス および尿素プラズマ)はそれぞれアルギニン加水分解または 尿素加水分解によって培地をアルカリ化します。鳥類マイコプラズマに関しては、フレイ培地の酸性化はM. ガリセプティカム

結果

異種細菌に対する非吸着ポリクローナルマイコプラズマ・ニューモニエ抗血清のイムノブロッティング活性
イムノブロッティングの結果(図2)で示されているように交差反応性は実際に存在し、ポジティブコントロール(レーン1)と比較して、肺炎球菌抗原の一部はスクリーニングされた細菌と共有されています。これらの交差反応の強度は変動した。例えば、M. gallisepticumおよびM. imitans抗原は、鳥類のマイコプラズマであることに加えて、M. pneumoniae抗血清(レーン9および10)と最も強い反応性を示した。反対に、尿素プラズマ尿素溶解の2つのヒト臨床分離株のどちらも反応性を示さなかった(レーン7および8)。しかし、残りのヒト生殖器マイコプラズマ種M.ホミニス、M.ファーメンタンス、およびM.......

ディスカッション

この論文では、主に特定のスクリーニングを確実にするために開発された社内ELISAの一般的な説明を示します。 M. pneumoniae 感染症。ELISAアッセイ自体のプロトコルに関する詳細、およびいくつかの前処理および後処理ステップが提供されます。このアッセイの特異性は、吸着技術によって保証されます。この手順は、ヒトおよび鳥類の診断用に開発されたELISA試験で以前に説明されています。 Mycoplasmas^17,24.また、ライム病などの他の細菌感染症の診断のためのELISAアッセイにも採用されました。²⁵.これらの3つの論文では、吸着がELISA特異性を高めるのに役立つことが証明されました。^17,24,25.本ELISAアッセイの場合、吸着のために.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-クロロ-1-ナフトール	Sigma-Aldrich	C6788-50 TAB
バクトペプトン	BD	211677
バクトトリプトン	BD	211705
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A9647-50 G
炭酸塩重炭酸緩衝液	Sigma-Aldrich	C3041-50 キャップ
カゼイン	Sigma-Aldrich	C7078-1 KG
CMRL1066	VWR	P0058-N1L
D-グルコース	Sigma-Aldrich	G7528-1KG
Difco PPLO Broth	BD	255420	Frey media
ELISA plate-Reader	MULTISKAN GO, Thermo Scientific	Ref: 51119200
Fetal Bovine serum	Capricorn Scientific	FBS-12A
ヤギペルオキシダーゼ結合抗ヒト IgG	Abcam	ab6759
ヤギペルオキシダーゼ結合抗ウサギ IgG	Life Technologies	656120
塩酸 37%	Prolab	2025.290
過酸化水素 (H2O2)、溶液 30%	Scharlau	HI01361000
L-arginin	Sigma-Aldrich	A5006-1KG
LB ブロス	チュニス		ニスのパスツール研究所の細菌学研究室によって提供
されましたMycoplasma pneumoniaeウサギで産生されたポリクローナル抗血清	チュニス		された血清は、チュニスのパスツール研究所でウサギの免疫によって製造されました
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド	Sigma-Aldrich	N7004-10G
Nunc Maxisorp 平底 96 ウェルマイクロタイタープレート	Invitrogen	44-2404-21
ペニシリン G ナトリウム (1 MIU)	PANPHARMA
フェノール レッド	フルカ ケミカ	77660
スキム ミルク	MP バイオメディカル	902887
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S6297-1KG
炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S7795-1KG
塩化ナトリウム (NaCl)	ノバキム	PS02805
硫酸 (H2SO4) 95-97%	Merck	1007311011
Thimerosal	USB	22215
TMB基板(3,3'、5,5'テトラメチルベンジジン溶液)	Abcam	ab142042
Trizmaベース	Sigma-Aldrich	T6791-1 KG
Tween 20	Sigma-Aldrich	1379-500 ML
酵母抽出物、粉末、超高純度	Thermo Scientific	J23547

のパスツール研究所で調製 チュのパスツール研究所で産生