Summary
我们介绍了一种使用微控制器板连接设备量化 支架 习惯化的方法，该设备可以在指定的力和频率下传递机械脉冲。我们还包括组装设备和以最小化外部扰动的方式设置实验的方法。
Abstract
学习通常与复杂的神经系统有关，但越来越多的证据表明，各个层次的生命，包括单个细胞，都可以表现出智能行为。在自然系统和人工系统中，学习是基于新信息的自适应更新系统参数，而智能是促进学习的计算过程的衡量标准。 腔腱支架 是一种单细胞池塘栖息生物，表现出习惯化，这是一种学习形式，其中行为反应在重复刺激后减少。 支架 响应机械刺激而收缩，这是水生捕食者的明显逃逸反应。然而，反复的低力扰动会诱发习惯性，表现为收缩概率的逐渐降低。在这里，我们介绍了一种使用微控制器板连接设备量化 支架 习惯化的方法，该设备可以以指定的力和频率传递机械脉冲，包括构建设备和以最小化外部扰动的方式设置实验的方法。与前面描述的机械刺激 Stentor方法相比，该装置允许在单个实验过程中在计算机控制下改变刺激力，从而大大增加了可以应用的输入序列的多样性。了解单个细胞水平的习惯将有助于表征独立于复杂电路的学习范式。
Introduction
学习通常与复杂的神经系统有关，但越来越多的证据表明，各个层次的生命，包括单个细胞，都可以表现出智能行为。在自然系统和人工系统中，学习是基于新信息1对系统参数的适应性更新，而智能是促进学习的计算过程的度量2。
腔棘是一种 单细胞池塘栖息生物，表现出习惯化，这是一种学习形式，其中行为反应在重复刺激后减少3. 支架 响应机械刺激而收缩3，这是水生捕食者的明显逃逸反应。然而，反复的低力扰动会诱发习惯，表现为收缩概率的逐渐降低3。习惯性的 支架 在接受高力机械刺激4 或光刺激5后仍会收缩。这些观察结果与汤普森和斯宾塞关于动物习惯化的经典标准一致6，强烈表明最初的收缩反应减少是由于学习而不是疲劳或ATP消耗。作为一种自由生活的细胞， 可以在 不受周围细胞太多干扰的情况下进行研究，就像在多细胞组织中一样。几个附加功能使 Stentor 成为学习的易处理系统：其大尺寸（1毫米），可量化的习惯反应3，易于注射和显微操作7，完全测序的基因组8以及RNA干扰（RNAi）工具的可用性9。使用这种模式生物在没有大脑或神经系统的情况下探索细胞学习需要可重复的程序来刺激 支架 细胞并测量反应。
在这里，我们介绍了一种使用微控制器板连接设备量化 支架 习惯的方法，该设备可以以指定的力和频率传递机械脉冲，包括构建设备和以最小化外部扰动的方式设置实验的方法（图1）。了解单个细胞水平的习惯将有助于表征独立于复杂电路的学习范式。
图 1：习惯化实验设置。 将含有 支架 的培养皿放置在习惯化装置的柔性金属尺子上。然后，习惯化装置的电枢以指定的力和频率撞击金属尺，在细胞场上产生刺激波。USB显微镜相机记录 支架 对刺激的反应。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：习惯化实验工作流程摘要。 该图显示了使用习惯化装置研究 支架 所涉及的基本步骤。这个数字是用 BioRender.com 创建的。改编自“工艺流程图”，由 BioRender.com （2022）。从 https://app.biorender.com/biorender-templates 检索。请点击此处查看此图的大图。
Protocol
注意：习惯化实验工作流程的摘要如图 2所示。
1. 组装习惯化装置
- 将电机驱动器连接到电机（请参阅 图 3）。
- 将驱动器板上标有 A 的两根电线连接到电机上的蓝色和红色电线。将驱动器板上标有 B 的两根电线连接到电机上的绿线和黑线。
注：从上方向下看驱动板，电机线位于顶部，四根输入线应按以下顺序连接到电机引线：蓝色、红色、黑色和绿色。
- 将驱动器板上标有 A 的两根电线连接到电机上的蓝色和红色电线。将驱动器板上标有 B 的两根电线连接到电机上的绿线和黑线。
- 构建 图4所示的试验板电路，特别注意以正确的极性连接LED。
- 将 Vcc （+5 V） 从驱动板连接到白色面包板的上轨，将 Gnd 从驱动板连接到面包板的底部轨。
- 将试验板的接地连接到微控制器板的接地引脚。将绿色 LED、红色 LED、开关和按钮线分别连接到微控制器板数字引脚 8、9、10 和 11。
- 将微控制器板数字引脚 2 和 3 连接到驱动板导线 Step 和 Dir。
- 将微控制器板数字引脚 4、5、6 和 7 连接到驱动板电线。
- 将引脚 4 连接到 MS1，将引脚 5 连接到 MS2，将引脚 6 连接到 MS3，并将引脚 7 连接到启用。
- 使用 12 V 电源为驱动板供电。将 12 V 电源插入通过两根红线连接到电机驱动板的黑色/绿色适配器插头。
注：请勿将12 V电源插入微控制器板插头。 - 将控制程序 （https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino） 下载到微控制器板上。
- 使用 USB 电缆将微控制器板连接到计算机，计算机也将用作微控制器板的电源。
- 检查用户控件是否正常工作。
- 确认滑动开关已打开和关闭自动模式。在自动模式下，系统将按用户指定的定期间隔执行步骤（见下文）。
- 检查自动模式打开时绿色 LED 是否亮起。
- 检查红色 LED 是否在电机施加脉冲之前闪烁 1 秒。红色 LED 是一个警告灯，指示系统何时即将发出机械脉冲。
- 测试红色按钮，无论系统是否处于自动模式，每次按下按钮时都会触发 1/16 微步。
图 3：习惯化装置的组件。 组装机器需要所有贴有标签的电子设备。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：电子原理图。 这是面包板上的电路。连接到微控制器板的电线按照协议中的说明进行编号。D1 和 D2 分别是红色和绿色 LED，通过 330 个 Ω 电阻接地。两个开关由10 KΩ电阻上拉。 请点击此处查看此图的大图。
2. 设置习惯化实验
- 获取 支架。
- 用0.01%聚鸟氨酸溶液涂覆35毫米板。
- 向平板中加入 3 mL 的 0.01% 聚鸟氨酸溶液，放置过夜。
- 用超纯水清洗盘子两次，用巴氏杀菌泉水（PSW）清洗一次（材料表）。
- 将 3.5 mL PSW 加入 35 mm 板中。
- 在6孔板中清洗 支架 （材料表）。
- 向第一个孔中加入 3 mL PSW，向第二孔和第三个孔中加入 5 mL PSW。使用 P1，000 移液器将 2 mL 支架从 培养皿中加入到 6 孔板的第一个孔中。
- 用体视显微镜（材料表）识别单个支架，然后使用 P20 移液器将 100 个支架从第一个孔转移到第二个孔。
- 用体视显微镜识别单个 支架 ，然后使用 P20 移液器将 100 个支架 从第二个孔转移到第三个孔。
- 使用 P200 移液器将总体积为 500 μL 的 100 Stentor 从 6 孔板的第三个孔转移到 35 mm 板中，使得 35 mm 板中的最终体积为 4 mL。
- 将一张（7 cm x 7 cm）白纸粘贴到习惯装置上的金属尺上。确保纸张的左边缘距离最靠近电枢的标尺末端 2 厘米。
- 使用双面胶带将 35 毫米板的底部粘附在习惯装置上尺子顶部的 2 英寸 x 2 英寸纸的中心。
- 将35mm板放在习惯化装置上至少2小时（可以延长至过夜），盖子关闭。在整个适应期间，将板保持在与实验光条件相匹配的环境光条件下（即，不要使细胞受到明/暗波动）。此外，请确保板不会因意外推挤而受到任何机械扰动。
- 将 USB 显微镜相机（材料表）直接置于 35 mm 支架板上方。如有必要，在通用串行总线（USB）显微镜相机下方放置一个支柱，例如移液器吸头盒，以调整高度。或者，可以使用环形支架来调节高度。
- 在笔记本电脑（材料表）上安装网络摄像头记录器应用程序，并使用它来通过显微镜输入 可视化 细胞。
- 打开网络摄像头录像机应用程序，然后从下拉菜单中选择USB显微镜。调整USB显微镜相机上的焦点，使细胞清晰可见。
- 调整USB显微镜相机的位置，以最大化视野中的细胞数量。
- 打开微控制器板串行监视器：选择 无行尾 并将其设置为 9，600 波特。
- 使用微控制器板程序上的 l 命令降低电枢，直到它几乎不接触标尺。如有必要，请使用 r 命令抬起手臂以调整确切位置。
注： 如果电枢距离标尺很远，请键入 d 命令以禁用电机线圈电流，以便臂可以手动向标尺移动。手动移动臂后，使用 e 命令启用电机线圈电流并保持臂锁定到位。如果在实验开始前适当降低，电枢的底尖应距尺子左边缘 1 厘米。电枢将通过敲击标尺来传递机械脉冲。 - 使用 i 命令初始化习惯化设备上的自动模式。
- 在命令行中输入步长。级别 5 是最小的步骤，级别 1 是最大的步骤。级别 4 是用于基线习惯化实验的步长。
注意：5 级刺激会导致尺子向下移动 ~0.5 毫米;4 级导致向下位移 ~1 毫米;3 级导致向下位移 ~2 毫米;2 级导致向下位移 ~3-4 毫米;和 1 级导致向下位移 ~8 毫米。5 级刺激导致电枢对标尺的向下峰值力为 ~0.122 N;4 级导致向下峰值力为 ~0.288 N;和 3 级导致 ~0.557 N 的向下峰值力。由于电枢接触后发生的显着标尺振荡，1级和2级产生的向下力更难用测功机凭经验量化。 - 输入脉冲之间的时间（以分钟为单位）。用于基线习惯化实验的间隔为1分钟。
- 通过按红色录制按钮开始使用网络摄像头录像机应用程序拍摄视频。然后，拨动习惯化装置上的开关，以第一次自动机械脉冲传递开始实验。
3. 分析实验视频
- 在视频中出现第一个机械脉冲之前，暂停并计算支架的数量，这些 支架 都锚定在 35 毫米板的底部并以细长的喇叭状形状延伸（图 5A，视频 1）。
- 在第一次脉冲之后，立即计算既固定在板底部又收缩成球状形状的 支架 的数量（图5B，视频1）。
注意：收缩的细胞很容易从细长的细胞中辨别出来，因为在收缩事件3期间，支架在10毫秒内将其体长缩短了50%以上。 - 将第二个计数除以第一个计数，以确定响应机械刺激收缩的 支架 分数。
- 对实验视频中的所有机械脉冲重复步骤3.1-3.3。
图5： 接受 机械刺激后支架收缩 。 （A） 支架 处于细长状态并锚定在培养皿底部。（B） 支架 在接受习惯化装置的4级机械刺激后收缩。这些图像是用USB显微镜拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：支架收缩的视频。支架每分钟从习惯化装置接收 4 级机械刺激。这些细胞尚未习惯，因此它们在接收脉冲后收缩。细胞位于放置在习惯化装置顶部的培养皿中。请点击此处下载此视频。
Representative Results
上述方法，使用频率为1 tap/min的4级机械脉冲，应在1小时内逐渐降低 支架 的收缩概率。这表明习惯化（见 图6，视频2）。
图 6：基线习惯。在以1 tap/min的频率（n = 22-27）接收4级机械脉冲后，支架的收缩概率在1小时内逐渐下降。请点击此处查看此图的大图。
视频 2.习惯性支架的视频。细胞在以1 tap/min的频率接收相同力的机械脉冲1小时后接收4级机械刺激。大多数细胞在一小时内已经习惯了刺激，因此不会收缩。请点击此处下载此视频。
改变机械脉冲传递的力和/或频率可以改变 支架 习惯性动力学。例如，以 1 次抽头/分钟的频率使用 2 级脉冲可在 1 小时内排除习惯化（见 图 7）。5 级脉冲应引起少量至零 的 Stentor 收缩。
图 7：在 1 小时内缺乏习惯以获得更强的力量。 在以1 tap/min的频率（n = 7-33）接收2级机械脉冲后1小时内， Stentor 的收缩概率不会明显下降。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
协议中最关键的步骤涉及确保 支架 保持在发生宫缩的最佳条件下。习惯化测定中的收缩反应要求 支架 使用其粘性固定固定在表面上，因为它们在自由游泳时很少收缩。然而，用于习惯化实验的35 mm培养皿的底面通常不利于锚定，除非涂有聚鸟氨酸。此外， 在 习惯化实验开始之前，支架不能暴露于任何机械扰动至少 2 小时，因为 支架 忘记时间尺度为 2-6 小时3。如果 Stentor 在习惯化实验开始时间的2小时内接受机械刺激，则这种先前的刺激可能会在实验之前诱导轻微的习惯化，从而降低习惯化装置发出第一个机械脉冲后的收缩概率。最后，在分析阶段，重要的是只计算脉冲后收缩的 支架 数量 - 而不是脉冲传递之前发生的任何偶然的自发收缩 - 以获得响应机械刺激收缩的细胞比例的准确读数。
通过改变习惯化装置传递的机械脉冲的力和频率，可以很容易地修改协议以研究不同类型的习惯化动力学。这也为探索 Stentor中可能发生的其他类型的学习（例如敏化）提供了机会。微控制器板程序代码本身也可以进行调整，以向 Stentor提供不同模式的机械抽头。
使用此协议进行故障排除的一个潜在问题是支架锚定的频率低，这可能会限制在习惯化实验中可以观察到的支架数量。在最近未喂食或被污染的支架培养物中，锚定频率有时会降低。为了解决这个问题，应该清洗一批新鲜的Stentor以开始新的培养物，并根据Lin等人10中描述的方案定期喂养它们。
该协议的局限性在于 一次只能测试 一个支架板，导致相对较低的通量测量。此外，当前的软件不允许单细胞图像分析的自动化。因此，所获得的大多数数据都是在人口一级获得的。习惯化装置和图像分析工具的未来模型可能有助于高通量单细胞实验。
Stentor的习惯化以前已经使用Wood3描述的方法进行了研究，但这种新协议允许实验自动化。自动化不仅允许研究人员可重复地传递指定力和频率的机械脉冲，而且还有助于长期习惯化实验，因为设备可以在没有监督的情况下运行数天。此外，使用步进电机而不是Wood实验3中使用的螺线管可以降低随着时间的推移而退磁的风险，并且还允许在单个实验过程中改变刺激的强度。
研究细胞习惯化可能会揭示注意力缺陷/多动障碍（ADHD）和习惯性受损的图雷特综合征等疾病的临床见解11。 支架 习惯化机制也可能揭示独立于复杂细胞回路的新的非突触学习范式。最后，关于单细胞学习的见解可以激发重编程多细胞组织内细胞的方法 - 这是对抗疾病的另一种潜在途径。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Tatyana Makushok关于 Stentor 学习的无数讨论。这项工作由NSF资助MCB-2012647和NIH资助R35 GM130327以及Fourmentin-Guilbert基金会的I2CELL奖资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
References
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