אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנו מדווחים על מערכת זיהוי נגיפי DNA מהירה, קלה ליישום, רגישה מאוד, ספציפית לרצף ונקודת טיפול (POC), המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) ומערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA. דנ"א המטרה מוגבר ומזוהה על ידי RPA ו-CRISPR/Cas12a בנפרד, מה שמפעיל את פעילות המחשוף ההיקפי של Cas12a שחותכת כתב DNA עם תווית פלואורופורית ומכלילה פלואורסצנטיות. לזיהוי POC, מיקרוסקופ סמארטפון נייד בנוי לצלם תמונות פלואורסצנטיות. חוץ מזה, מודלים של למידה עמוקה לסיווג בינארי של דגימות חיוביות או שליליות, להשגת דיוק גבוה, נפרסים בתוך המערכת. וירוס צפרדע 3 (FV3, סוג Ranavirus, משפחה Iridoviridae) נבדק כדוגמה למערכת זיהוי POC זו של נגיף DNA, וגבולות הזיהוי (LoD) יכולים להשיג 10 aM תוך 40 דקות. ללא מפעילים מיומנים ומכשירים מגושמים, הסיווג הנייד והזעיר בסיוע RPA-CRISPR/Cas12a-SPM עם בינה מלאכותית (AI) מראה פוטנציאל גדול לזיהוי וירוסי POC DNA ויכול לסייע במניעת התפשטות וירוסים כאלה.
מבוא
בשנים האחרונות, מגיפות של מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי וירוסים שונים התרחשו לעתים קרובות, כולל מגיפת נגיף האבולה (EVD) בשנת 20141 ו 20182, תסמונת הנשימה במזרח התיכון (MERS) בשנת 20153, מגיפת מחלת נגיף זיקה בשנת 20154, מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) הנגרמת על ידי תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2)5 ואבעבועות הקוף המתמשכת הנגרמת על ידי נגיף אבעבועות הקוף (MKPV) בשנת 20226. התפרצויות פתאומיות אלה של מחלות זיהומיות מגיפות גורמות למספר רב של מקרי מוות ומביאות להפסדים כלכליים עצומים ותסיסה חברתית. נדרשת בדחיפות מערכת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. עיבוד דגימות
- קח וירוס צפרדע 3 (FV3, סוג Ranavirus, משפחה Iridoviridae), וירוס DNA דו גדילי. בחר את הגן הראשי capsid (mcp) כיעד לזיהוי FV3 מכיוון שהוא שמור מאוד ונחשב בדרך כלל כיעד לזיהוי ranavirus. רצף היעד שנבחר מוצג בטבלה 1.
הערה: וירוס צפרדע 3 נלקח כדוגמה בפרוטוקול זה. - להכנת מקטעי DNA ממוקדים, השתמש במקטעי DNA של הגן mcp מ- FV3 וב- Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus (ISKNV, Ranavirus אחר).
הערה: במחקר זה, מקטעי דנ"א המטרה התקבלו באופן מסחרי מחברה הרשומה בטבלת החומרים. הם נחשבים המטרה ואת השליטה של גילוי לאחר מכן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטה זו מתמקדת במערכת זיהוי מהירה, קלה ליישום, רגישה ביותר ונקודת טיפול (POC) עבור נגיפי DNA. תכנון זוגות פריימרים עבור תגובת RPA ועיצוב crRNA עבור תגובת CRISPR/Cas12a הם שניים מהחלקים החיוניים מכיוון שהם ישפיעו על יעילות תגובת RPA-CRISPR/Cas12a וישפיעו על הזיהוי והסיווג הבאים.
בשיטה זו, FV3 נחשב כדוגמה לזיהוי נגיף DNA. כמה זוגות פריימר RPA עבור FV3 מתוכננים, והיעיל ביותר נבחר ומוודא שהוא מראה יעילות הגברה טובה, אשר ניתן לאשר על ידי הבטחת בהירות וגודל הפסים באמצעות אלקטרו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בשיטה זו, אנו מפתחים מערכת מהירה, קלה ליישום, רגישה מאוד, ספציפית לרצף וזיהוי וירוסי DNA POC בסיוע AI. לאחר קבלת דגימות, RPA מוחל כדי להגביר את רצף המטרה, ולאחר מכן CRISPR/Cas12a יכול לזהות את DNA המטרה ולשחרר פלואורסצנטיות, אשר מגדילה את אות האיתור. מיקרוסקופ סמארטפון נייד בנוי לצלם תמונות פלואורסצנטיות, ומודלים של למידה עמוקה עם למידת העברה משמשים לסיווג בינארי של תמונות הדגימות החיוביות והשליליות. FV3 נלקח כמדגם חיובי בשיטה זו ולאחר מכן נחקר מנקודות מבט מרובות כדי לשפר את הספציפיות והרגישות של המערכת המוצעת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 31970752, מדע, טכנולוגיה, חדשנות הוועדה של עיריית שנזן JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; מימון פתוח של מעבדת מפרץ שנזן, SZBL2020090501004; הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין 2020M680023; והמנהל הכללי של המכס של הרפובליקה העממית של סין 2021HK007.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הגברה 20x | OLYMPUS | OPLN20X | |
| 532 ננומטר לייזר ירוק | Thorlabs | PL201 | עם הספק פלט של 0.9 |
| mW 535 ננומטר אורך גל חיתוך | כרום | AT535 | |
| 6x מאגר טעינת DNA | Thermo scientific | R0611 | |
| 96 בארות מיקרופלייט שחור | קורנינג משולב | 3603 | שחור עם תחתית שטוחה שקופה |
| עדשה אספרית | Lubang | N/A | |
| מסנן פס | פס SEMROCK | FF01-542/27-25 | |
| Bsu DNA פולימראז | ATG ביוטכנולוגיה | M103 | שבר גדול |
| crRNA | סנגון ביוטק | N/A | |
| שברי DNA | סנגון ביוטק | N/A | |
| מחזיקי Dichroic | Ruicage | N/A | |
| מראה דיכרואית | SEMROCK | FF555-Di03-25x36 | עם אורך גל חיתוך של 535 ננומטר |
| ערכת מיצוי ג'ל E.Z.N.A | אומגה ביוטק | D2500-02 | |
| EnGen Lba Cas12a (Cpf1) | ניו אינגלנד ביולאבס (בייג'ינג) בע"מ | M0653T | |
| מחזיקי מסננים | Ruicage | N/A | |
| Fluorophore-ssDNA-Quencher מדווח בודק | סנגון ביוטק | N/A | TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) כפלואורופור ב-5 הקצוות; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) כמרווה בשלושת הקצוות |
| GP32 | ATG Biotechnology | M104 | |
| ImageJ | גרסה 1.53t 24 | הורד מ-https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| קורא מיקרופלייט | SPARK, TECAN | N / A | |
| מכשיר PCR תרמי רב בלוק | LongGene | N / A | |
| NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרים | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer r2.1 | ניו אינגלנד Biolabs (בייג'ינג) בע" | B6002S | 10x CRISPR / Cas12a מאגר תגובה |
| טיפול בפלזמה חמצן | אלקטרו-טכניקה מוצרים | N/A | |
| פתוגן מושבת, ללא מיצוי חומצות גרעין, מאגר ישיר ל-PCR עם פרוטאינאז K (PINDBK) | Ebio | PINDBK -25 מ"ל | |
| זוגות פריימר PCR | Sangon Biotech | N/A | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| RPA פריימר | זוגות סנגון ביוטק | N/A | |
| סמארטפון | Huawei | שלבי תרגום Mate10 | |
| Ruicage | N/A | ||
| מסנני צפיפות ניטרלית משודרים | Thorlabs | ND40A | |
| עדשות אכרומטיות משולשות | Thorlabs | TRH127-020-A | |
| UvsX | ATG ביוטכנולוגיה | M105 | |
| UvsY | ATG ביוטכנולוגיה | M106 |
מקורות
- Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
- The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola v....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
