DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu bir CRISPR/Cas12a sistemi ile birleştiren bir protokol sunuyoruz ve hasta başı DNA virüsü tespiti için yapay zeka destekli bir sınıflandırma ile taşınabilir akıllı telefon mikroskobu oluşturuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve CRISPR/Cas12a sistemini birleştiren hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas, diziye özgü ve bakım noktası (POC) DNA virüsü tespit sistemini rapor ediyoruz. Hedef DNA, RPA ve CRISPR/Cas12a tarafından ayrı ayrı amplifiye edilir ve tanınır, bu da Cas12a'nın florofor söndürücü etiketli bir DNA raportörünü parçalayan ve floresansı genelleştiren kollateral bölünme aktivitesini tetikler. POC tespiti için taşınabilir akıllı telefon mikroskobu, floresan görüntüler çekmek üzere üretilmiştir. Ayrıca, pozitif veya negatif numunelerin ikili sınıflandırması için derin öğrenme modelleri, yüksek doğruluk elde ederek sistem içinde konuşlandırılır. Kurbağa virüsü 3 (FV3, cins Ranavirus, Iridoviridae familyası) bu DNA virüsü POC tespit sistemi için bir örnek olarak test edilmiştir ve tespit sınırları (LoD) 40 dakika içinde 10'ye ulaşabilir. Yetenekli operatörler ve hantal cihazlar olmadan, yapay zeka (AI) destekli sınıflandırmaya sahip taşınabilir ve minyatür RPA-CRISPR/Cas12a-SPM, POC DNA virüsü tespiti için büyük potansiyel gösterir ve bu tür virüslerin yayılmasını önlemeye yardımcı olabilir.
Giriş
Son yıllarda, 20141 ve 20182'de Ebola virüsü hastalığı (EVH) salgını, 2015'te Orta Doğu Solunum Sendromu (MERS)3, 2015'te Zika virüsü hastalığı salgını4, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin neden olduğu Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) dahil olmak üzere farklı virüslerin neden olduğu bulaşıcı hastalık salgınları sık sık meydana gelmiştir.5 ve 2022'de Maymun Çiçeği virüsünün (MKPV) neden olduğu devam eden Maymun Çiçeği (MKPV)6'dir. Salgın bulaşıcı hastalıkların bu ani salgınları çok sayıda ölüme neden olmakta ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Numunelerin işlenmesi
- Çift sarmallı bir DNA virüsü olan Kurbağa Virüsü 3'ü (FV3, cins Ranavirüs, Iridoviridae ailesi) ele alalım. FV3'ün tespiti için hedef olarak majör kapsid (mcp) genini seçin, çünkü yüksek oranda korunur ve genellikle ranavirüs tespiti için hedef olarak kabul edilir. Seçilen hedef dizi Tablo 1'de gösterilmiştir.
NOT: Kurbağa Virüsü 3 bu protokolde örnek olarak alınmıştır. - Hedef DNA fragmanlarının hazırlanması için, FV3 ve Enfeksiyöz Dalak ve Böbrek Nekroz Virüsünden (ISKNV, başka bir Ranavirüs) mcp geninin DNA fragmanlarını kullanın.
NOT: Bu çalışmada....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yöntem, DNA virüsleri için hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas ve bakım noktası (POC) algılama sistemine odaklanır. RPA reaksiyonu için primer çiftleri tasarımı ve CRISPR/Cas12a reaksiyonu için crRNA tasarımı, RPA-CRISPR/Cas12a reaksiyonunun verimliliğini etkileyeceği ve sonraki algılama ve sınıflandırmayı etkileyeceği için temel parçalardan ikisidir.
Bu yöntemde FV3, DNA virüsü tespitinin bir örneği olarak kabul edilir. FV3 için bazı RPA primer çiftleri tasarla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntemde yapay zeka yardımıyla hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas, diziye özgü ve POC DNA virüsü tespit sistemi geliştiriyoruz. Numuneler alındıktan sonra, hedef diziyi amplifiye etmek için RPA uygulanır ve ardından CRISPR/Cas12a, hedef DNA'yı tanıyabilir ve algılama sinyalini büyüten floresan serbest bırakabilir. Taşınabilir akıllı telefon mikroskobu, floresan görüntüleri almak için üretilmiştir ve pozitif ve negatif numunelerin görüntülerinin ikili sınıflandırması için transfer öğrenmeli derin öğrenme modell.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı 31970752, Shenzhen Belediyesi Bilim, Teknoloji, İnovasyon Komisyonu JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Shenzhen Körfezi Laboratuvarı Açık Finansmanı, SZBL2020090501004; Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı 2020M680023; ve Çin Halk Cumhuriyeti Gümrük Genel İdaresi 2021HK007.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 20x amplifikasyon | OLYMPUS | OPLN20X | |
| 532 nm yeşil lazer | Thorlabs | PL201 | 0.9 mW çıkış gücü ile |
| 535 nm kesme dalga boyu | krom | AT535 | |
| 6x DNA yükleme tamponu | Thermo scientific | R0611 | |
| 96 kuyucuklu siyah mikroplaka | Corning Incorporated | 3603 | Siyah, düz şeffaf tabanlı |
| Asferik lens | Lubang | N/A | |
| 535 nm kesme dalga boyuna sahip | dikroik ayna | SEMROCK | FF555-Di03-25-36 |
| E.Z.N.A Jel Ekstraksiyon Kiti | Omega Biotek | D2500-02 | |
| EnGen Lba Cas12a (Cpf1) | New England Biolabs (Beijing) LTD | M0653T Filtre | |
| tutucular | Ruicage | N/A | |
| Florofor-ssDNA-Söndürücü muhabir probları | Sangon Biotech | 5 | uçta florofor olarak TAMRA (karboksi tetrametilrodaminon); BHQ2 (Kara Delik Söndürücü-2) 3 uçta söndürücü olarak |
| GP32 | ATG Biyoteknoloji | M104 | |
| ImageJ | Açık kaynaklı | Sürüm 1.53t 24 | https://imagej.nih.gov/ij/ 'dan indirildi; |
| Mikroplaka okuyucu | SPARK, TECAN | N/A | |
| Çok Bloklu termal Döngüleyici PCR cihazı | LongGene | N/A | |
| NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometreler | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer r2.1 | New England Biolabs (Beijing) LTD | B6002S | 10x CRISPR/Cas12a Reaksiyon tamponu |
| Oksijen plazma tedavisi | Elektro-Teknik Ürünler | N/A | |
| Patojen İnaktive Edici, Nükleik asit ekstraksiyonu içermeyen, Proteinaz K (PINDBK) ile Doğrudan PCR'ye Tampon | Ebio | PINDBK -25mL | |
| PCR primer çiftleri | Sangon Biotech | N/A | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| RPA primer çiftleri | Sangon Biotech | N/A | |
| Akıllı Telefon | Huawei | Mate10 | |
| Çeviri aşamaları | Ruicage | N/A | |
| İletilen nötr yoğunluk filtreleri | Thorlabs | ND40A | |
| Üçlü akromatik lensler | Thorlabs | TRH127-020-A | |
| UvsX | ATG Biyoteknoloji | M105 | |
| UvsY | ATG Biyoteknoloji | M106 |
Kaynaklar
- Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
- The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
