干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。
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本文内容
摘要
摘要
将人类多能干细胞（hPSCs）分化为可分泌胰岛素的β细胞，为研究β细胞功能及糖尿病治疗提供了重要材料。然而，在获得能够充分模拟天然人类β细胞特性的干细胞来源β细胞方面，仍存在挑战。在既往研究基础上，已生成hPSC来源的胰岛样细胞，进而建立了一种可提高分化效率与一致性的实验方案。本方案在第1至第4阶段采用胰腺前体细胞试剂盒，第5至第7阶段则采用基于2014年先前发表论文所改进的方案（以下简称“R-方案”）。本方案详细描述了使用胰腺前体细胞试剂盒及直径为400 µm的微孔板生成胰腺前体细胞簇、在96孔静态悬浮体系中采用R-方案进行内分泌分化，以及 体外 人多能干细胞衍生胰岛的表征与功能评估也包含在内。该完整方案首先需要1周时间进行人多能干细胞的初始扩增，随后约5周时间获得可产生胰岛素的人多能干细胞胰岛。具备基本干细胞培养技术以及生物学检测培训经验的人员均可重复本方案。
引言
胰腺β细胞可响应血糖水平升高而分泌胰岛素。由于1型糖尿病（T1D）中β细胞遭受自身免疫破坏1，或2型糖尿病（T2D）中β细胞功能障碍2，导致胰岛素分泌不足的患者，通常需要外源性胰岛素治疗。尽管这种疗法可挽救生命，但其对血糖的调控远不如功能性β细胞动态分泌胰岛素那样精确。因此，患者常面临危及生命的低血糖事件，以及由长期高血糖波动引发的其他并发症。移植人尸体来源的胰岛可成功恢复T1D患者的严格血糖控制，但受限于胰岛供体的可获得性，以及难以纯化出适合移植的健康胰岛3,4。这一难题原则上可通过使用人多能干细胞（hPSCs）作为替代起始材料来解决。
由人多能干细胞生成分泌胰岛素的胰岛：当前策略 体外 通常旨在模拟胚胎胰腺发育过程 体内5,6这需要了解相关的信号通路，并在特定时间添加相应的可溶性因子，以模拟胚胎胰腺发育的关键阶段。胰腺发育程序始于定型内胚层的形成，该阶段以转录因子叉头盒A2（FOXA2）和Y染色体性别决定区蛋白17（SOX17）的表达为标志。7定型内胚层的连续分化....
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方案
本方案基于在无饲养层条件下对人多能干细胞（hPSC）系（包括H1、HUES4 PDXeG和Mel1 INSGFP/W）的研究。本节详细描述了具体操作步骤，并在代表性结果部分提供了Mel1 INSGFP/W分化的支持性数据。我们建议，当使用本文未提及的其他人多能干细胞系时，可能需要进一步优化条件。有关本方案中使用的所有试剂和溶液的详细信息，请参见材料表。
1. 分化培养基与溶液的制备
注意：所有待配制的溶液见表1，分化培养基见表2。
- 在无菌生物安全柜中准备所有细胞培养用培养基和试剂。使用前，将与细胞培养相关的溶液和基础培养基在水浴中短暂预热至 37 °C。
注意：如下所述，每天新鲜配制分化培养基，加入添加剂后当日使用。或者，根据生产商说明书，胰腺前体细胞试剂盒也支持预先配制较大体积的培养基，可在数天内分次使用。两种培养基配制方法均有效。请注意，不建议将培养基长时间置于水浴中。若每日新鲜配制培养基，建议将添加剂分装保存，以避免反复冻融。
2. 将人多能干细胞分化为胰腺前体细胞
-
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结果
我们开发了一种七步法混合策略，用于将干细胞分化为可分泌胰岛素的人多能干细胞来源的胰岛（hPSC-islets）。该策略在前四个阶段采用胰腺前体细胞试剂盒进行平面培养，随后基于先前报道的方法改进并实施后续步骤。6 在静态悬浮培养条件下进行最后三个阶段（图1）。根据本方案，在细胞接种后24小时（第0阶段）确保培养物达到接近完全汇合（90%–100%）对于大多数hPSC系的有效分化起始至关重要（图2A）。强烈建议测试不同的接种密度，以确定特定细胞系的最佳培养条件。在第1阶段培养期间，由于存在悬浮的死细胞，培养基可能会呈现浑浊状态，这在此阶段较为常见。只要贴壁细胞已完全覆盖培养容器表面，该现象不会影响试剂盒的分化效率。在第2至第4阶段，随着细胞增殖和细胞死亡减少，单层细胞逐渐变得更加致密，耗尽的培养基也不再像第1阶段那样浑浊（图2A）。如使用胰岛素报告基因 Mel1 INS 所示GFP/W hESC.......
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讨论
本文描述了一种七阶段杂交方案，可在培养40天内生成能够在葡萄糖刺激下分泌胰岛素的人多能干细胞胰岛 体外在这些多个步骤中，高效诱导定型内胚层被认为对最终的分化结果具有重要的起始作用18,27,28. 根据制造商的操作说明，接种密度为 2.6 × 105/cm2 建议启动分化，细胞在第1阶段培养基中培养2天。为确保细胞在第1天达到接近汇合状态（90%-100%），我们强烈建议在使用新的hPSC细胞系时测试接种密度，因为最佳接种密度可能有所不同。例如，在我们实验室测试的三个hPSC细胞系中，接种密度为1.6-1.80 × 105/cm2，而不是 2.60 × 105/cm2，被确定为最佳接种密度。将第1阶段的培养时间从2天延长至3天，并在第1B阶段培养基中额外培养1天，可提高FOXA2的纯度+
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披露
Timothy J. Kieffer 在撰写本文期间是 ViaCyte 的员工。其他作者声明无竞争利益。
致谢
我们衷心感谢 STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、干细胞网络（Stem Cell Network）、JDRF 以及加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Research）提供的支持。Jia Zhao 和 Shenghui Liang 是 Michael Smith Health Research BC 培训生奖的获得者。Mitchell J.S. Braam 是 Mitacs Accelerate 博士后奖学金的获得者。Diepiriye G. Iworima 是亚历山大·格拉汉姆·贝尔加拿大研究生奖学金以及加拿大大学妇女联合会 1989 年纪念埃科尔理工学院奖（CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award）的获得者。我们诚挚感谢来自 MCRI 及莫纳什大学（Monash University）的 Edouard G. Stanley 博士提供 Mel1 INS GFP/W 细胞系，以及阿尔伯塔糖尿病研究所胰岛核心实验室（Alberta Diabetes Institute Islet Core）在人胰岛的分离与分发方面提供的支持。我们同时感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所成像与流式细胞术平台（Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry facilities at the Univer....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3） | Sigma | T6397 | 甲状腺激素 |
| 4% PFA 溶液 | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | 应在通风橱中操作 |
| 96孔超低吸附平底板 | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | 平底；用于最后三个阶段的静态悬浮培养 |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | 第4阶段细胞的解离试剂 |
| Aggrewell400 板 | STEMCELL Technologies | 34415 | 直径为 400 µm 的微孔板 |
| Aggrewell800 板 | STEMCELL Technologies | 34815 | 直径为 800 µm 的微孔板 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗人 FOXA2（山羊 IgG） | R&D Systems | IC2400G | 流式细胞术中按 1:100 稀释；用于检测第1阶段细胞 |
| Alexa Fluor 488 山羊 IgG 同型对照 | R&D Systems | IC108G | 流式细胞术中按 1:100 稀释 |
| Alexa Fluor 488 小鼠抗人 SST（小鼠 IgG2B） | BD Sciences | 566032 | 流式细胞术中按 1:250 稀释；用于检测第7阶段细胞 |
| Alexa Fluor 488 小鼠 IgG2B 同型对照 | R&D Systems | IC0041G | 流式细胞术中按 1:500 稀释 |
| Alexa Fluor 647 小鼠抗人 C-肽（小鼠 IgG1κ） | BD Pharmingen | 565831 | 流式细胞术中按 1:2,000 稀释；用于检测第7阶段细胞 |
| Alexa Fluor 647 小鼠抗人 INS（小鼠 IgG1κ） | BD Sciences | 565689 | 流式细胞术中按 1:2,000 稀释 |
| Alexa Fluor 647 小鼠抗人 NKX6.1（小鼠 IgG1κ） | BD Sciences | 563338 | 流式细胞术中按 1:33 稀释；用于检测第4阶段细胞 |
| Alexa Fluor 647 小鼠抗人 SOX17（小鼠 IgG1κ） | BD Sciences | 562594 | 流式细胞术中按 1:50 稀释；用于检测第1阶段细胞 |
| Alexa Fluor 647 小鼠 IgG1κ 同型对照 | BD Sciences | 557714 | 流式细胞术中按 1:50 稀释 |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-β 信号通路抑制剂 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | 微孔清洗液 |
| 检测腔室 | Cellvis | D35-10-1-N | 用于静态葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验和共聚焦成像 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | 用于免疫染色程序 |
| CK19 抗体 | DAKO | M0888 | 整体免疫荧光中按 1:50 稀释 |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8769 | 培养基添加剂 |
| DAPI | Sigma | D9542 | 用于细胞核复染 |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | 基质稀释液 |
| 驴抗山羊 Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| 驴抗山羊 Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| 驴抗兔 Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| 驴抗兔 Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| 驴抗绵羊 Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 整体免疫荧光中按 1:500 稀释 |
| DPBS | Sigma | D8537 | 不含 Ca2+ 和 Mg2+ |
| ELISA，胰岛素，人源 | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | 用于人胰岛素测定 |
| 游离脂肪酸 BSA | Proliant | 68700 | 培养基添加剂 |
| 固定和通透溶液试剂盒 | BD Sciences | 554714 | 包含 Fix/Perm 和 10x Perm/Wash 溶液 |
| 温和细胞解离试剂 | STEMCELL Technologies | 7174 | 用于维持培养期间 hPSCs 的团块传代 |
| 胰高血糖素抗体 | Sigma | G2654 | 整体免疫荧光中按 1:400 稀释 |
| GLUT1 抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 整体免疫荧光中按 1:200 稀释 |
| GlutaMAX-I（100x） | Gibco | 35050061 | L-谷氨酰胺补充剂 |
| 甘油 | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | 用于组织透明化和封片 |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch 抑制剂 |
| 肝素 | Sigma | H3149 | 培养基添加剂 |
| ITS-X（100x） | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺；培养基添加剂 |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP 拮抗剂 |
| MAFA 抗体 | Abcam | ab26405 | 整体免疫荧光中按 1:200 稀释 |
| Matrigel，hESC 级别 | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | 用于血管表面包被的细胞外基质 |
| MCDB131 培养基 | Life technologies | 10372019 | 基础培养基 |
| mTeSR1 完全试剂盒 | STEMCELL Technologies | 85850 | 包含干细胞培养基和 5x 补充剂 |
| N-Cys（N-乙酰半胱氨酸） | Sigma | A9165 | 抗氧化剂 |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | 培养基添加剂 |
| NEUROD1 抗体 | R&D Systems | AF2746 | 整体免疫荧光中按 1:20 稀释 |
| NKX6.1 抗体 | DSHB | F55A12-c | 整体免疫荧光中按 1:50 稀释 |
| 胰多肽抗体 | R&D Systems | AF6297 | 整体免疫荧光中按 1:200 稀释 |
| PBS | Sigma | D8662 | 含 Ca2+ 和 Mg2+ |
| PDX1 抗体 | Abcam | ab47267 | 整体免疫荧光中按 1:200 稀释 |
| PE 小鼠抗人 GCG（小鼠 IgG1κ） | BD Sciences | 565860 | 流式细胞术中按 1:2,000 稀释；用于检测第7阶段细胞 |
| PE 小鼠抗人 NKX6.1（小鼠 IgG1k） | BD Sciences | 563023 | 流式细胞术中按 1:250 稀释 |
| PE 小鼠抗人 PDX1（小鼠 IgG1k） | BD Sciences | 562161 | 流式细胞术中按 1:200 稀释；用于检测第4阶段细胞 |
| PE 小鼠 IgG1κ 同型对照 | BD Sciences | 554680 | 流式细胞术中按 1:2,000 稀释 |
| PE 小鼠抗人嗜铬粒蛋白 A（CHGA，小鼠 IgG1k） | BD Sciences | 564563 | 流式细胞术中按 1:200 稀释 |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL 酪氨酸激酶抑制剂 |
| 全反式视黄酸 | Sigma | R2625 | 对光敏感 |
| RIPA 裂解缓冲液，10x | Sigma | 20-188 | 用于激素提取 |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH 抑制剂 |
| SLC18A1 抗体 | Sigma | HPA063797 | 整体免疫荧光中按 1:200 稀释 |
| 生长抑素抗体 | Sigma | HPA019472 | 整体免疫荧光中按 1:100 稀释 |
| STEMdiff 胰腺前体细胞试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05120 | 包含基础培养基和补充剂 |
| 突触素抗体 | Novus | NB120-16659 | 整体免疫荧光中按 1:25 稀释 |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 用于通透处理 |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | 维生素 E 类似物 |
| TrypLE 酶快速型 | Life technologies | 12604-021 | 用于 hPSCs 单细胞传代的细胞解离酶试剂 |
| 胰蛋白酶1/2/3 抗体 | R&D Systems | AF3586 | 整体免疫荧光中按 1:25 稀释 |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK 抑制剂 |
| 硫酸锌 | Sigma | Z0251 | 培养基添加剂 |
参考文献
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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