测量肌腱中的局部组织应变 通过 开源数字图像相关法

摘要

本文介绍了一种用于测量肌腱离体组织内局部二维组织应变的开源数字图像相关算法。该技术的准确性已通过多种方法得到验证，并可供公众使用。

摘要

肌腱细胞所承受的应变引起了广泛的科学关注 原位 以及这些应变如何影响组织重塑。基于这一研究兴趣，已开发出多种分析技术，用于测量加载过程中肌腱离体样本内的局部组织应变。然而，在多个案例中，这些技术的准确性和灵敏度尚未被报道，且目前尚无任何算法公开可用。这使得在肌腱离体样本中广泛开展局部组织应变测量变得困难。因此，本研究的目标是开发一种经过验证、易于使用且可公开获取的分析工具，用于测量肌腱离体样本中的局部组织应变。具体而言，本研究对一种公开可用的增强拉格朗日数字图像相关（ALDIC）算法进行了改进，通过追踪小鼠跟腱在单轴拉伸过程中细胞核的位移，实现二维应变的测量。此外，通过分析数字变换后的图像，并将计算所得应变值与独立技术（即光漂白条纹法）测得的结果进行比较，验证了所计算应变的准确性。最后，本研究在算法中引入了一种技术，利用计算得到的位移场重建参考图像，可在缺乏已知应变值或第二种测量方法的情况下评估算法的准确性。该算法能够测量高达0.1的应变，精度达0.00015。通过比较重建参考图像与实际参考图像的技术，成功识别出含有错误数据的样本，并表明在数据质量良好的样本中，约85%的位移场是准确的。最后，小鼠跟腱中测得的应变结果与以往文献报道一致。因此，该算法是一种高度实用且可适应性强的工具，可用于准确测量肌腱中的局部组织应变。

引言

肌腱是具有机械敏感性的组织，会因机械负荷而发生适应性改变或退变^1,2,3,4。由于机械刺激在肌腱细胞生物学中起着重要作用，人们高度关注肌腱细胞在天然组织环境中受载时所经历的应变情况。目前已开发出多种实验和分析技术用于测量肌腱中的局部组织应变，包括利用散斑图案或光漂白线（PBLs）进行表面应变的2D/3D数字图像相关（DIC）分析^5,6,7,8、通过测量组织内单个细胞核中心到中心距离的变化来评估应变^9,10，以及一种考虑了面外运动和三维变形的新型全场3D DIC方法¹¹。然而，这些技术的准确性与灵敏度仅在少数研究中被报道，且目前尚无任何技术实现公开共享，这限制了这些方法的广泛应用与推广。

本研究的目的是开发一种经过验证的分析工具，用于测量肌腱离体样本中的局部组织应变，该工具应易于获取且操作简便。所采用的方法基于一种公开可用的增广拉格朗日数字图像相关（ALDIC）算法，该算法由 Yang 和 Bhattacharya 用 MATLAB 编写¹²。该算法已针对肌腱样本的分析进行了改进，并通过应用于数字化变换图像进行验证，同时将实际肌腱样本中测得的应变与光漂白线方法获得的结果进行比较。此外，还在算法中增加了额外功能，以便在缺乏已知应变值或无二次测量技术的情况下，仍能验证计算所得位移场的准确性。因此，该算法是一种高度实用且灵活的工具，可用于精确测量肌腱中的局部二维组织应变。

方案

本研究已获得宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 组织准备

1. 本实验方案中，取2至4月龄雄性C57BL/6小鼠的跟腱。
   注意：也可使用小鼠或其他小型动物的不同肌腱或韧带。
   1. 在跟腱表面的皮肤上做切口，暴露跖肌腱及其周围结缔组织，然后用手术刀将其去除。
   2. 将暴露的比目鱼肌和腓肠肌从后肢分离，并用手术刀小心地从跟腱上刮除。
   3. 使用旋转工具上的切割轮附件将跟骨与足部其余部分分离。
2. 将组织置于1.5 mL含5 µg/mL的5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素（DTAF）和0.1 M碳酸氢钠缓冲液的溶液中，在室温下于旋转混合器上染色20分钟。该溶液可对组织中的蛋白质（如细胞外基质）进行染色。
   注意：在上述20分钟染色期间，应完成步骤1.3。
3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）配制1:1,000的DRAQ5溶液用于细胞核染色。使用涡旋混合器将溶液混匀。
4. 在步骤1.2的20分钟孵育结束后，将组织从DTAF溶液转移至DRAQ5溶液中，在室温下避光孵育10分钟。

2. 肌腱加载与图像采集

注意：本实验方案需要一种可安装在共聚焦显微镜上方的拉伸装置。本研究中采用了 Peterson 和 Szczesny 所描述的微型拉伸装置¹³。

1. 将肌腱放入拉伸加载装置的夹具中。在将夹具安装到加载装置之前，使用数字卡尺测量跟骨附着点与对侧夹具之间的距离。该距离即为肌腱的标距长度。
   1. 或者，可先将夹具安装到加载装置上，再插入肌腱，并推至接触以确定电机的零位位移位置。在插入肌腱后记录电机的位移，可能提供更准确的夹具间标距长度。
2. 将夹具安装到含有 PBS 的加载装置中，以维持组织的水合状态。尽可能将肌腱与显微镜图像的 x 轴或 y 轴对齐，以便算法输出的 x 方向应变和 y 方向应变与肌腱的轴向相对应。
   注意：本研究中，肌腱沿x轴方向排列。若无法将肌腱完全与图像坐标轴对齐，则可使用标准应变转换方程，将算法输出的x方向应变和y方向应变转换为与肌腱纵向/垂直方向对齐的应变值。¹⁴.
3. 预加载1 g张力于肌腱，并根据需要施加循环载荷以对样本进行预处理。在本方案中，由于研究目的是验证所测得的局部组织应变，而非测量组织的材料特性，因此未进行预处理。如果需要测量依赖于加载历史的宏观尺度材料特性，则建议进行预处理。完成预处理及恢复后，重新施加1 g的预加载。
4. 如需要，可在组织中心区域对四条间距为80 µm的线进行光漂白处理（参见Peterson和Szczesny）¹³ 有关更多详细信息）。
   注意：光漂白线条用于验证 ALDIC 算法的测量结果，并非执行 ALDIC 本身所必需。线条的数量和间距可进行调整，且应选择适当位置以避免样品中可能降低线条清晰度的伪影。
5. 在靠近夹具的组织左右两端重复进行光漂白操作。
6. 使用共聚焦显微镜，在1 g预负荷条件下获取DTAF和DRAQ5荧光的三维图像（x,y：1.25 µm/像素，z：2.5 µm/像素）。
7. 以0.5%/s的应变速率进行应变 ramp 至2%应变。注意，应变速率和增量应变幅度可进行调整。
8. 让组织应力松弛10分钟。
   注意：应力松弛的持续时间应选择得当，以确保在图像采集期间样品处于近似准静态载荷条件下。为判断应力松弛持续时间是否合适，需确定应力松弛最后1分钟内力-时间曲线的斜率补充图1），并将该斜率乘以总成像持续时间。在本研究中，最大应变增量时施加的力变化从未超过5%。
9. 在组织变形后，再获取一幅容积图像。
10. 重复步骤 2.7–2.9，直至达到目标最终应变。本文中选择的最终应变值为 12%。

3. 图像处理

1. 使用 ImageJ 或 Fiji 对 DRAQ5（细胞核）通道的每个体视图像创建最大强度 z 投影。这些投影将作为 ALDIC 分析所需的 2D 斑点图像。
2. 将最大强度 z 投影保存为 .tiff 文件，并按照以下命名规范进行命名。
   1. 图像名称的第一个字符应为数字。
   2. 该数字应与图像在菌株分析过程中被处理的顺序相对应。例如，第一幅图像名称应以“1”开头，第二幅图像应以“2”开头。可以选择不同的起始数字，但必须按顺序递增。示例命名格式如下：“0_Experiment1_MaxZProjection”。
3. 将所有重命名后的最大强度 z 投影文件保存至同一文件夹中。

4. 光漂白条带分析代码的安装与应用

注意：仅当需要通过光漂白线验证ALDIC算法的准确性时，才需执行以下步骤。该代码通过计算每组光漂白线内各光漂白线之间距离的平均归一化变化，来确定局部组织应变。在本研究中，进一步将所有光漂白线组（即位于中心及左右两端）的平均局部值再次取平均，以获得每个样本的单一平均局部组织应变值。该值随后用于评估ALDIC算法的准确性。

1. 从 GitHub 下载“PBL Code”文件夹（https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc），并将其中所有内容移至 MATLAB 的工作目录。
2. 打开“Micro_Mech_Template.m”MATLAB 脚本。
   1. 点击 运行，并选择包含体图像的一个图像文件。体图像可以是以下任意一种文件类型：.lsm、.tiff、.nd2。
   2. 软件将自动加载文件夹中的所有图像，并显示参考体图像的投影图像。当提示时，单击鼠标左键 创建多点线，以追踪样品左右两端的边缘；单击鼠标右键 结束一条线。输入完成后，若边缘位置正确，则点击 确定 接受结果。
   3. 当提示时，在样品上绘制一条随机的对角线作为参考线。
   4. 输入所创建的光漂白线条数量，并使用多点线逐条追踪这些光漂白线。
   5. 如果结果可接受，则确认接受；若结果有误，则进行调整并重新处理。
3. 对所有图像重复步骤 4.2，并将所有已标记线条的图像移至同一个文件夹中。
4. 打开脚本“Micro_Mech_Strain.m”。
   1. 点击 运行 执行代码，并选择一个已保存的、包含已追踪光漂白线的图像。
   2. 选择图像后，点击 确定，确认所选的配套图像是否正确。

5. 创建数字转换图像

注意：仅当需要使用数字变换图像验证 ALDIC 算法的准确性时，才需执行以下步骤。这些图像通过人工变换参考图像，模拟已知大小的均匀二维应变场。

1. 从 GitHub 下载代码“Digital_strain.m”（https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc）。
2. 打开并运行该代码。
3. 当系统提示时，输入所需的最大施加应变值、施加应变增量以及泊松比，然后点击 确定。
   注意：本实验中，最大施加应变为 0.1（10%），施加应变增量为 0.02（2%），泊松比取值为 1，该值与肌腱拉伸实验数据一致^15,16。该代码使用 MATLAB 内嵌函数 imwarp 及输入参数（如应变增量、泊松比）生成数字化变换后的图像。
4. 当系统提示时，选择未变形的参考图像。
5. 对于每个应变增量，程序将显示参考图像与变换后图像的叠加图。变换后的图像将保存至目录中，文件名为“DigitallyTransformedX%Strain”，其中 X 为应变增量。

6. 应变计算与验证代码的安装与应用

1. 从 GitHub 下载“Strain Calculation and Validation Code”文件夹（https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc），并将所有内容移至 MATLAB 工作目录
2. 根据 Yang 和 Bhattacharya¹² 的方法安装 mex C/C++ 编译器。步骤总结如下：
   1. 在 MATLAB 命令窗口中输入“mex -setup”并按 Enter，检查是否已安装 mex C/C++ 编译器。
   2. 如果出现错误提示，表明编译器不支持或不存在，则继续执行步骤 6.3 和步骤 6.4。
   3. 如果没有错误，则继续执行步骤 6.5
3. 要下载 mex C/C++ 编译器，请访问“https:/tdm-gcc.tdragon.net/”，并选择 TDM-gcc 编译器。
4. 将下载的编译器安装到已知位置。
5. 返回 MATLAB 命令窗口，输入：“setenv("MW_MINGW64_LOC","[在此输入您的安装路径]")”。例如，可以是“setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")”。如果该命令成功执行，则表示 mex 编译器已正确安装。
6. 进入“main_aldic.m”函数脚本，并将第 22 行修改为与步骤 6.5 中执行的命令一致。
7. 打开脚本“Strain_calc_and_validate.m”。
8. 点击 运行 以开始图像分析。
9. 当系统提示时，根据需要调整 ALDIC 参数的值。
   注意：窗口大小应为子集大小的 0.25 至 1 倍。有关参数选择的更多信息，请参阅在线用户手册：(https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
   _Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual)。
   1. 本研究中使用了以下参数值：
      子集大小（像素）：20
      窗口大小（像素）：10
      求解 ALDIC 的方法：有限差分法（1）
      未使用并行计算（1）
      初始猜测值计算方法：基于图像金字塔的多重网格搜索（0）
10. 当系统提示时，选中“是”复选框，使算法自动保存所需变量集合的平均值、标准差和二维图谱（例如，x-应变、y-应变、剪切应变、异常区域等）。选择需要保存的变量，然后点击 确定。
11. 当系统提示时，根据需要调整参数。
    1. 本实验中使用了以下参数值：
       用于计算应变的周围点数（numP）：12
       用于识别异常区域的相关系数阈值（corr_threshold）：0.5
       异常区域分析的子区域大小（像素）（Subsize）：32
12. 当系统提示时，选择包含重命名后的最大强度 z 投影图像的文件夹。请注意，该软件会自动执行增量式 ALDIC 以确定变形图像的应变场。也就是说，每张变形图像都作为下一张变形图像的新“参考”图像。与累积式 ALDIC 相比，这种方法提高了结果的准确性（补充图 2），在累积式 ALDIC 中，每张变形图像均与原始（0% 应变）参考图像进行比较。若要执行累积分析，请加载图像，但仅选择原始参考图像和感兴趣的变形图像。
    注意：正应变计算公式为 λ - 1，其中 λ 为组织拉伸率。组织拉伸率按 计算，其中 N = [1 0]^T 或 [0 1]^T 分别对应 x 方向和 y 方向，C = F^T F，其中 F 是通过 ALDIC 算法输出的每个数据点周围“numP”个点计算得到的变形梯度。剪切应变按 计算，其中 。
13. 当系统提示时，单击鼠标左键创建一个四点的多边形，以定义测量应变的兴趣区域。从左上角的点开始，并按顺时针方向依次指定后续点。
    注意：保存在 MATLAB 工作区中的变量“Storage”包含平均 x-应变、x-应变标准差、平均 y-应变、y-应变标准差、平均剪切应变、剪切应变标准差以及异常区域百分比的所有数值。异常区域根据步骤 6.13 中选定的兴趣区域内进行的相关系数分析来定义。“NuclearTrackingResults”文件夹（可通过修改第 555 和 556 行重命名）存储了步骤 6.10 中指定的所有图表。该文件夹还包含一个名为“Results”的电子表格文件，其中存储了步骤 6.10 中指定的所有均值和标准差。

结果

在分析实际组织样本的应变场之前，首先使用小鼠跟腱内细胞核的数字化应变/变换图像对ALDIC方案进行验证。具体而言，通过对图像进行变换，以数字化方式在x方向上产生2%、4%、6%、8%和10%的均匀应变，并模拟泊松比为1^15,16通过将ALDIC算法计算得到的平均应变值与已知的数字应变进行比较，评估该算法的准确性。此外，通过评估应变值的标准差以确定应变场的非均质性。ALDIC算法（采用增量分析方法）计算得到的应变与施加于数字变换图像的实际应变之间的差异如图所示。 图1. ALDIC 软件计算得到的 x 方向平均应变始终低于实际施加的应变（图1A），且误差的幅度随着施加应变的增大而增加。然而，对于所有应变增量，误差幅度始终小于0.00015。在y方向的应变也存在轻微的低估（图1C）。x方向应变和y方向应变在整个月区域内计算应变的标准差也随施加应变的...

讨论

本文的目的是提供一种开源且经过验证的方法，用于测量肌腱在拉伸载荷下的二维应变场。该软件的基础是基于一种公开可用的ALDIC算法¹²。该算法被嵌入到一个更大的MATLAB程序中，并增加了增量（而非累积）应变分析的功能。随后，将这一改进后的算法应用于肌腱的拉伸测试，并通过两种不同技术（即数字变换图像和利用光漂白线进行应变测量）评估其准确性。此外，还增加了一项功能，可在无需已知真实应变值的情况下，评估ALDIC测量在任意样本上的准确性。

对数字化转换图像的分析表明，该算法能够以极小的误差精确测量高达10%的应变，而这一精度无法通过实际小鼠跟腱的拉伸测试进行评估，因为跟腱样本中的应变幅值较低。然而，将ALDIC算法计算的小鼠跟腱应变与利用光漂白标记线测量的应变进行比较后发现，ALDIC技术的误差处于光漂白标记线自身测量变异范围内。作为最终验证，通过从变形图像重建参考图像，并将重建结果与实际参考图像进行比较，评估了ALDIC算法计算的完整二维位移场的准确性。在数字化转换的图像中，随着施加应变的增大，异常区域数量和应变误差增加，尤其是在累积式AL...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-DTAF（5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素），单一异构体	ThermoFisher	D16
卡尺	Mitutoyo	500-196-30
共聚焦显微镜	Nikon	A1R HD
Corning LSE 涡旋混合器	Corning	6775
DRAQ5 荧光探针溶液（5 mM）	ThermoFisher	62554
MATLAB	MathWorks	R2022b
拉伸加载装置	N/A	N/A	如 Peterson 等，2020 年所述的拉伸加载装置（参考文献 13）
Tube Revolver 旋转混合仪	ThermoFisher	88881001