말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
말라리아는 기생충 플라스모디움(Plasmodium)에 의해 발생하는 치명적인 질병이며 암컷 아노펠레스 모기에 물려 전염됩니다. 척추동물 숙주의 피부에 모기에 의해 침착된 Plasmodium의 sporozoite 단계는 임상 말라리아를 시작하기 전에 간에서 필수 발달 단계를 거칩니다. 우리는 간에서 Plasmodium 발달의 생물학에 대해 거의 알지 못합니다. sporozoite 단계에 대한 접근과 이러한 sporozoite를 유전적으로 변형할 수 있는 능력은 Plasmodium 감염의 특성과 간에서 발생하는 면역 반응을 연구하는 데 중요한 도구입니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites의 생성을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 우리는 혈액 병기 P. berghei를 유전자 변형하여 이 형태를 사용하여 Anopheles 모기가 혈액 식사를 할 때 감염시킵니다. 유전자 변형 기생충이 모기에서 발달한 후, 생체 내 및 시험관 내 실험을 위해 모기 타액선에서 기생충의 포자석 단계를 분리합니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 소단위 11(GFP11)을 발현하는 P. berghei의 새로운 균주의 sporozoites를 생성하여 프로토콜의 타당성을 입증하고 간 단계 말라리아의 생물학을 조사하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
서론
말라리아 예방 및 치료에 대한 약물 개발과 연구의 발전에도 불구하고 말라리아로 인한 전 세계적인 질병 부담은 여전히 높습니다. 매년 50만 명 이상이 말라리아로 사망하며, 사하라 사막 이남 아프리카1과 같은 말라리아 풍토병 지역에 거주하는 어린이들의 사망률이 가장 높다. 말라리아는 플라스모디움(Plasmodium)이라는 기생충에 의해 발생하는데, 이 기생충은 침샘에 기생충을 품고 있는 암컷 아노펠레스 모기에 물려 인간에게 전염됩니다. 플라스모듐(Plasmodium)의 감염 단계인 스포로조이트(sporozoite)는 혈액 식사 중에 척추동물 숙주의 피부에 침착되어 혈류를 통해 이동하여 간세포를 감염시키고, 간세포를 감염시키기 전에 필수 발달(적혈구 전 말라리아 구성)을 거칩니다. 적혈구의 감염은 말라리아의 혈액 단계를 시작하고 질병과 관련된 이환율과 사망률 전체를 담당합니다 2,3.
플라스모디움(Plasmodium)의 적혈구 전 발달의 의무적 특성으로 인해 플라스모디움은 예방 백신 및 약물 개발 ....
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프로토콜
우리 실험실의 척추동물과 관련된 모든 연구는 조지아 대학의 동물 사용 지침 및 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. P. berghei 감염 마우스의 생성
- 야생형 P. berghei 기생충을 사용하여 수컷 또는 암컷, 6-8주 된 C57BL/6(B6) 마우스에서 혈액 단계 감염을 시작합니다. 이를 위해 400μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 재구성된 냉동 보존된 P. berghei에 감염된 혈액(2 x 105 감염된 적혈구)을 복강 내(i.p.)로 1개 또는 2개의 기증 마우스에 전달합니다.
- 감염 후 5일(d.p.i.)에 기증자 마우스에서 후안와 출혈을 통해 수집된 신선한 혈액을 두 마리의 순진한 B6 마우스로 옮깁니다. 이를 위해 200μL의 혈액을 수집하고 300μL의 PBS로 재구성한 다음 200μL ip를 수용 마우스에 주입합니다. 이 시점에서 기증자의 기생충혈증이 2%-5%인지 확인하십시오.19,20.
- 이전에 설명한 대로 기생충혈증을 모니터링합니다
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결과
주혈기의 빈도와 발달을 결정하는 것은 충분한 생존 가능한 기생충이 형질주입을 위한 최적의 단계에 있는지 확인하는 데 중요합니다. 미성숙 분열체는 적혈구의 전체 세포 내 공간을 채우지 않는 더 적은 수의 메로조이트의 존재에 의해 완전히 성숙한 분열체와 구별될 수 있습니다(그림 1B). 배양된 혈액에서 혈액 도말을 만들 때 감염된 적혈구가 터져 혈액 도말에서 유리 세포외 메로조이트가 관찰될 수 있다는 점에 유의해야 합니다(그림 1). 이러한 merozoites는 단계 2.5에서 schizonts의 빈도 평가에 포함되지 않습니다.
사용자가 모기 생리학이나 소규모 해부에 익숙하지 않은 경우 모기에서 침샘을 제거하는 것이 어려울 수 있습니다. 타액선을 모기로부터 분리하는 동안 침샘의 반투명도를 사용하여 불투명한 모기 잔해와 구별할 수 있습니다(그.......
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토론
우리는 실험실에서 위의 프로토콜을 사용하여 여러 계통의 형질전환 P. berghei 기생충을 만들었습니다. P. berghei에 최적화되어 있지만, 이 프로토콜을 사용하여 형질전환 P. yoelii sporozoites를 생성하는 데에도 성공했습니다. 형질주입된 분열체를 마우스에 주입한 후, 기생충은 플라스미드 대조군이 없는 그룹을 포함하여 모든 그룹에서 일반적으로 3 d.p.i. 이하로 검출될 수 있다. 선택은 전기천공법 후 기생충의 생존 가능성을 보장하기 위해 기생충혈증이 검출된 후에만 시작됩니다. 또한 약물 선택을 준비할 때 염산으로 물을 산성화하여 pH를 4로 낮추면 피리메타민이 완전히 용해될 수 있습니다. 플라스미드가 없는 대조군에서는 기생충이 완전히 제거될 것으로 예상되며, 형질주입제를 접종한 마우스는 감염된 상태로 유지됩니다. 대조군 마우스에서의 청소는 전형적으로 피리메타민 처리의 개시 후 5-8일 후에 발생한다. 주목할 점은, P. berghei 에 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 AI168307 SPK의 지원을 받았습니다. UGA CTEGD 유세포 분석 코어와 UGA CTEGD 현미경 코어에 감사드립니다. 또한 Ash Pathak, Anne Elliot, UGA Sporocore 직원들의 프로토콜 최적화에 기여한 공로를 인정합니다. 귀중한 통찰력, 토론 및 GFP11 및 GFP 1-10을 포함하는 모체 플라스미드에 대해 Daichi Kamiyama 박사에게 감사드립니다. 또한 Kurup 연구소 구성원의 끊임없는 지원, 인내, 격려에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 30 G x 1/2" 주사기 바늘 | Exel international | 26437 | |
| Alsever의 솔루션 | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa 기본 기생충 핵펙터 키트 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin(2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| 채혈 | BD 생명과학 | 365967 | 세럼 수집용 |
| C-Chip 일회용 혈구분석기 | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw 세포 배양 접시 | Greiner Bio-One | 627860 | |
| 원심분리기 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| 원심분리기 5910R | Eppendorf | 5910R | 기울기 원심분리용 |
| Delta Vision II - 도립 현미경 시스템 | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| 소 태아 혈청 | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 플라스미드 | Kurup Lab | pSKspGFP11 | PL0017 플라스미드 |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 세포 | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Hepa 1-6 세포에서 생성(ATCC Cat# CRL-1830) |
| 마우스 혈청 | 해부 매체에 사용 | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M 및 0.15 M percoll 용액 |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 RBC 전기천공에 사용 | |
| 파스퇴르 피펫 | VWR | 14673-043 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | P0781-100ML | |
| Percoll (밀도 구배 원료 배지) | Cytivia | 17-0891-02 | 프로토콜 |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (경구 투여용) | Sigma | 46706 | 준비 세부 정보: DMSO 2.5mL에 17.5mg Pyrimethamine을 추가합니다. Vortex, 완전히 용해해야 하는 경우; HCL을 사용하여 225mL의 dH2O의 pH를 4로 조정합니다. DMSO에 피리메타민을 넣고 250mL를 만듭니다. 설탕 10g을 첨가하여 약이 든 물을 규칙적으로 섭취하도록 유도합니다. 피리메타민은 빛에 민감합니다. 생쥐를 치료할 때는 어두운 병이나 알루미늄 호일로 덮인 병을 사용하십시오. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx 현미경 소프트웨어 | 적용 Precision | v6.1.3 |
참고문헌
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al.
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재인쇄 및 허가
