Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Malaria is een dodelijke ziekte die wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium en wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen . Het sporozoietstadium van Plasmodium dat door muggen in de huid van gewervelde gastheren wordt afgezet, ondergaat een fase van verplichte ontwikkeling in de lever voordat klinische malaria wordt geïnitieerd. We weten weinig over de biologie van de ontwikkeling van Plasmodium in de lever; toegang tot het sporozoietstadium en het vermogen om dergelijke sporozoïeten genetisch te modificeren zijn cruciale hulpmiddelen voor het bestuderen van de aard van Plasmodium-infectie en de resulterende immuunrespons in de lever. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het genereren van transgene Plasmodium berghei sporozoïeten. We modificeren P. berghei genetisch in het bloedstadium en gebruiken deze vorm om Anopheles-muggen te infecteren wanneer ze een bloedmaaltijd nemen. Nadat de transgene parasieten zich in de muggen hebben ontwikkeld, isoleren we het sporozoietstadium van de parasiet uit de speekselklieren van de mug voor in vivo en in vitro experimenten. We demonstreren de validiteit van het protocol door sporozoïeten te genereren van een nieuwe stam van P. berghei die het groen fluorescerende eiwit (GFP) subeenheid 11 (GFP11) tot expressie brengt, en laten zien hoe het kan worden gebruikt om de biologie van malaria in het leverstadium te onderzoeken.
Inleiding
Ondanks de vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen en onderzoek naar malariapreventie en -behandeling, blijft de wereldwijde ziektelast van malaria hoog. Elk jaar sterven meer dan een half miljoen mensen aan malaria, met de hoogste sterftecijfers onder kinderen die in malaria-endemische regio's wonen,zoals Afrika ten zuiden van de Sahara. Malaria wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium, die op mensen wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen die de parasiet in hun speekselklieren dragen. Het infectieuze stadium van Plasmodium - de sporozoïeten - wordt tijden....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het onderzoek met gewervelde dieren in ons laboratorium werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen voor diergebruik van de Universiteit van Georgia.
1. Generatie van P. berghei-geïnfecteerde muizen
- Start een infectie in het bloedstadium bij mannelijke of vrouwelijke, 6-8 weken oude C57BL/6 (B6)-muizen met behulp van wildtype P. berghei-parasieten. Om dit te doen, brengt u gecryopreserveerd P. berghei-geïnfecteerd bloed (2 x 105 geïnfecteerde rode bloedcellen), gereconstitueerd in 400 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), intraperitoneaal (i.p.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het bepalen van de frequentie en ontwikkeling van schizonten is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat voldoende levensvatbare parasieten zich in het optimale stadium voor transfectie bevinden. Onrijpe schizonten kunnen worden onderscheiden van volledig volwassen schizonten door de aanwezigheid van minder merozoïeten die niet de hele intracellulaire ruimte van de RBC vullen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat bij het maken van bloeduitstrijkjes uit gekweekt bloed, geïnfectee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben het bovenstaande protocol in ons laboratorium gebruikt om verschillende lijnen van transgene P. berghei-parasieten te maken. Hoewel geoptimaliseerd voor P. berghei, hebben we dit protocol ook met succes gebruikt om transgene P. yoelii-sporozoïeten te genereren. Na het injecteren van de getransfecteerde schizonten in muizen, zijn parasieten meestal niet later dan 3 d.p.i. detecteerbaar in alle groepen, inclusief de controle zonder plasmide. De selectie wordt pas gestart nadat parasitem.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie AI168307 aan SPK. We danken de UGA CTEGD Flow Cytometry Core en de UGA CTEGD Microscopy Core. We erkennen ook de bijdragen van Ash Pathak, Anne Elliot en het personeel van UGA Sporocore bij het optimaliseren van het protocol. We willen Dr. Daichi Kamiyama bedanken voor waardevolle inzichten, discussie en de ouderplasmiden die GFP11 en GFP 1-10 bevatten. We willen ook de leden van het Kurup-lab bedanken voor hun constante steun, geduld en aanmoediging.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | voor serumcollectie |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | Voor gradiëntcentrifugatie |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Gemaakt vanuit PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Gemaakt vanuit Hepa 1-6 cellen (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Gebruikt voor mosquito dissectie media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M en 0.15 M voor percoll oplossing |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Programma U-033 gebruikt voor RBC elektroporatie | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (voor orale toediening) | Sigma | 46706 | Bereidingsdetails: Voeg 17,5 mg Pyrimethamine toe aan 2,5 mL DMSO. Vortex, indien nodig om volledig op te lossen; Pas pH van 225 mL dH2O aan tot 4 met HCL. Voeg Pyrimethamine in DMSO toe aan water en breng tot 250 mL. Voeg 10 g suiker toe om regelmatige consumptie van het geneesmiddelwater te bevorderen. Pyrimethamine is lichtgevoelig. Gebruik een donkere fles of een fles bedekt met aluminiumfolie bij de behandeling van muizen. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
Referenties
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
