Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.
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Methodenartikel
Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Colliculus superior (SC), eine evolutionär konservierte Mittelhirnstruktur bei allen Wirbeltieren, ist das am weitesten entwickelte Sehzentrum vor der Entstehung der Großhirnrinde. Es empfängt direkte Eingaben von ~30 Arten von retinalen Ganglienzellen (RGCs), von denen jede ein bestimmtes visuelles Merkmal kodiert. Es bleibt unklar, ob der SC einfach nur Netzhautmerkmale erbt oder ob eine zusätzliche und möglicherweise de novo Verarbeitung im SC stattfindet. Um die neuronale Kodierung visueller Informationen im SC aufzudecken, stellen wir hier ein detailliertes Protokoll zur optischen Aufzeichnung visueller Reaktionen mit zwei komplementären Methoden in wachen Mäusen zur Verfügung. Eine Methode verwendet Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Kalziumaktivität mit Einzelzellauflösung abzubilden, ohne den überlagernden Kortex abzutragen, während die andere Weitfeldmikroskopie verwendet, um die gesamte SC einer mutierten Maus abzubilden, deren Kortex weitgehend unentwickelt ist. In diesem Protokoll werden diese beiden Methoden detailliert beschrieben, einschließlich der Tierpräparation, der Virusinjektion, der Kopfplattenimplantation, der Plug-Implantation, der Datenerfassung und der Datenanalyse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung visuell evozierte neuronale Reaktionen bei Einzelzellauflösung zeigt, und die Weitfeld-Kalzium-Bildgebung zeigt neuronale Aktivität über das gesamte SC. Durch die Kombination dieser beiden Methoden kann man die neuronale Kodierung im SC auf verschiedenen Skalen aufdecken, und eine solche Kombination kann auch auf andere Hirnregionen angewendet werden.
Einleitung
Der Colliculus superior (SC) ist ein wichtiges Sehzentrum bei allen Wirbeltieren. Bei Säugetieren erhält es direkte Eingaben von der Netzhaut und dem visuellen Kortex1. Während die optische Aufzeichnung im Kortex 2,3,4,5 weit verbreitet ist, wird ihre Anwendung im SC durch schlechte optische Zugänge behindert 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 <....
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Protokoll
Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Tierschutzrichtlinien durchgeführt und von der IACUC am Chinesischen Institut für Hirnforschung, Peking, genehmigt.
HINWEIS: Der Zeitplan für dieses Protokoll ist wie folgt: 1) Herstellung des Saugnapfes; 2) das Virus injizieren; 3) Implantieren Sie die Kopfplatte; 4) Implantieren Sie nach 3 Wochen den Pfropfen; 5) Führen Sie nach einer ~3-tägigen Erholung und Gewöhnung auf dem Laufband eine Zwei-Photonen-/Weitfeld-Bildgebung durch.
1. Vorbereitung eines Saugnapfes (Abbildung 1A)
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Ergebnisse
Die Abbildungen 1A,B zeigen, wie der Saugnapf bzw. die Stopfen hergestellt werden. Abbildung 2 zeigt, wie der Plug erfolgreich implantiert wird. Nach der Implantation des Plugs wird der posterior-mediale SC freigelegt, wie in Abbildung 2D dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Kalziumantwort von SC-Neuronen an einer Wildtyp-Maus, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen wurde. Das drei.......
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Diskussion
Kritische Schritte im Protokoll
Der kritischste Schritt ist die Kraniotomie in den Schritten 5.2 und 5.3. Erstens ist der Knochen 0,5 mm hinter dem Lambda dick und enthält Blutgefäße im Inneren, die während des Bohrvorgangs zu Blutungen führen können. Es sollte ein geeigneter Gelschaum vorbereitet werden, um die Blutung zu stoppen. Zweitens besteht eine gute Wahrscheinlichkeit für eine Angiorrhexis, wenn der Knochen direkt über der Sinus transversum entfernt wird. Zur Fehlerbehebung besteht ein altern.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (32271060) unterstützt. Y.-t.L. entwarf die Forschung, führte das Experiment durch, analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. Z.L. und R.W. führten das Experiment durch.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 16x Objektiv | Nikon | ||
| 50-mm-Objektiv | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm-Deckglas | Warner Instruments | CS-5R | |
| Bandpassfilter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| Butylcyanacrylat | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | ||
| Kamera für Weitfeldaufnahmen | Basler | acA2000-165µ m | |
| Koronabehandler | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroitische | Chroma-Technologie | T600/200dcrb | |
| Galvanometer | Cambridge Technology | ||
| Glasperlensterilisator | RWD | RS1502 | |
| Mikrobohrer | RWD | 78001 | |
| Mikromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| Photomultiplier Rohr | Hamamatsu | R3896 | |
| Drehgeber | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| selbsthärtender Zahnadhäsionsharzzement | SuperBond C& B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| Thermostat-Heizkissen | RWD | 69020 | |
| Ti:Saphir Laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| transluzenter Silikonkleber | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| Laufband | Xinglin Biology | ||
| Virus Stämme | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vektorkern am Chinesischen Institut für Hirnforschung, Peking | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J Wildtyp | Ressourcenzentrum für Labortiere am Chinesischen Institut für Hirnforschung, Peking | ||
| Emx1-Cre | Das Jackson Labor | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referenzen
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
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Nachdrucke und Genehmigungen
