脈管筋は内蝸牛電位の生成に不可欠です。ここでは、単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
脈管脈によって生成される内蝸牛電位は、適切な有毛細胞のメカノトランスダクション、そして最終的には聴覚を助長する環境を維持するために不可欠です。脈理血管の病状は聴力の低下をもたらす可能性があります。成体脈条血管の解剖は、焦点を絞った単一核捕捉とそれに続く単一核シーケンシングおよび免疫染色を可能にする。これらの技術は、単一細胞レベルで脈理血管の病態生理学を研究するために使用されます。
単一核シーケンシングは、脈管脈の転写解析の設定に使用できます。一方、免疫染色は、細胞の特定の集団を同定するのに引き続き有用です。どちらの方法も、前提条件として適切な脈理血管郭清を必要としますが、これは技術的に困難であることが判明する可能性があります。
概要
蝸牛は、スカラ前庭、スカラ中膜、およびスカラティンパニの3つの液体で満たされたチャンバーで構成されています。スカラ前庭とスカラティンパニにはそれぞれ外リンパが含まれており、外リンパには高濃度のナトリウム(138 mM)と低濃度のカリウム(6.8 mM)が含まれています1。スカラ培地には内リンパが含まれており、内リンパには高濃度のカリウム(154 mM)と低濃度のナトリウム(0.91 mM)が含まれています1,2,3。このイオン濃度の違いは、内蝸牛電位(EP)と呼ぶことができ、主に蝸牛の側壁に沿った脈管線条(SV)のさまざまなイオンチャネルとギャップ結合を通るカリウムイオンの移動によって生成されます4,5,6,7,8,9,10,11
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プロトコル
すべての動物実験および手順は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する国立研究所によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての実験プロトコルは、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所によって承認されました。すべての方法は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所の関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。
1.動物の安楽死
- C57BL / 6Jまたは Kcnj10-ZsGreenトランスジェニックマウス、生後30+(P30 +)、体重15〜20 gを使用します。
- 承認されたプロトコル(ここではCO2 窒息)を使用して成体マウス(年齢P30以上)を安楽死させる。二次ステップとして斬首を実行します。
注:免疫染色の場合、一部の抗体は、SVの毛細血管内の血液への非特異的結合のためにバックグラウンドシグナルを有する可能性があります。固定液による心臓灌流は、SVの毛細血管から血液を除去することによってこの問題に対処することができます。ただし、ほとんどの抗体はこの方法がなくても良好な結果を....
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結果
sNuc-Seqまたは免疫染色に使用するSVを単離する方法を紹介します。SVに関連する蝸牛の関連する解剖学的構造(図1)は、ユーザーがSVの構成と解剖プロトコルのステップをよりよく理解するのに役立ちます。
P30マウスからのSVのこのマイクロダイセクションの各ステップは、関連するビデオで詳しく説明されており、この解剖とSVの分離の主要なステップのスナップショットを 図2に示します。
sNuc-Seqは、異種SVにおける様々な細胞の転写プロファイルを調べるのに有用である。これを視覚化する方法の1つは、2D UMAPでクラスタリングすることです(図3)。sNuc-Seqから生成されたデータセットは、異なるデータ分析技術を用いて評価することができ、議論においてさらに概説される。
GS-IB4およびDA.......
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ディスカッション
シングルセルシーケンシングが登場する前は、多くの研究者がバルク組織分析を使用していましたが、細胞全体で平均化されたトランスクリプトームの分析しかできませんでした。特に、単一細胞およびsNuc-Seqは、それぞれ単一細胞または単一核のトランスクリプトームを単離することを可能にした32。この場合、単一核トランスクリプトームは、辺縁細胞、中間細胞、および基底細胞、ならびに紡錘細胞30について同定することができる。これにより、SV細胞型間の転写不均一性を調べることができ、将来的には、EPの生成と維持を含むSV機能に対するこれらの細胞型の寄与を調べるために使用できます。 sNuc-Seqを使用して生成されたデータセットは、全体的な転写の違いを理解しやすくし、UMAPプロットを使用して異なる細胞集団を比較するために、次元的に縮小された方法で表示できます。 図 4.sNuc-Seqデータセットの解釈のためにバイオインフォマティクス分析を行う方法は数多くあります。これらには、示差的発現解析、単一細胞.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、NIHの学内研究プログラム、NIDCD to M.H.(DC000088)によって部分的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10-&マイクロ;mフィルター(ポリエチレンエンテレフタラート) | PluriSelect | #43-50010-01 | sNuc-Seq |
| 18 x 18 mmカバーガラス | Fisher Scientific | 12-541A | ためのカバースリップ |
| ;mフィルター (ポリエチレンエンテレフタラート) | PluriSelect | #43-50030-03 | sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | SVの中間細胞でより容易に見られる色素を持つ汎用マウス系統。 |
| 細胞カウンター | ロゴ バイオシステム | L20001 | 細胞カウントに使用 |
| カリゾン・キュレット 5インチ、サイズ3 2.5mm | 生物医学研究機器 | 15-1020 | SVクロムの転送に使用 |
| GEM シングルセル 3' GEM キット v3.1 | クロム | PN-1000141 | シングルセル3'遺伝子発現ライブラリを生成 |
| クリア・マニキュア | フィッシャー・サイエンティフィック | NC1849418 | SVマウント |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Cultureディッシュ 解剖中に標本を保持するために使用される |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | 核標識に使用される染色剤 |
| Dounce ホモジナイザー | Sigma-Aldrich | D8938 | sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | の組織を均質化するために使用されますファインサイエンスツール | 11252-30 | 解剖用一般鉗子 |
| デュモン #55 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11255-20 | SV操作を容易にする細い先端付き鉗子 |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャー | 16000044 | sNuc-Seq グルースティックのステップに使用 |
| フィッシャーサイエンティフィック | NC0691392 | の取り付けに使用 | |
| プローブ | I21411、RRID:AB-2314662 | ||
| KCNJ10-ZsGreen | n/a | /a | SVの中間細胞でKCNJ10-ZsGreenを部分的に発現するトランスジェニックマウス |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | sNuc-Seqのステップに使用 |
| マウンティング試薬 | ThermoFisher | #S36940 | マウンティング試薬 |
| Corning | #353047 | ||
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | sNuc-Seqのステップに使用 |
| ヌクレアーゼフリーウォーター | サーモフィッシャー | 4387936 | sNuc-Seq |
| オービタルシェーカー | サイレントシェイク | SYC-2102A | |
| PBS | サーモフィッシャー | J61196 の免疫染色のステップに使用されます。AP | 免疫染色および解剖のステップに使用 |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | マウスの頭蓋骨の分割に使用 |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | 細胞カウントに使用 |
| Tween20 | サーモフィッシャー | AAJ20605AP | sNuc-Seqのステップに使用 |
| ツァイス STEMI SV 11 Apo 実体顕微鏡 | ツァイス | n/a | 解剖用顕微鏡 |
参考文献
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences.
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