Summary
يتم وصف طريقة محسنة لقياس ملامح ترطيب حبوب اللقاح في Arabidopsis thaliana هنا. توفر الطريقة الجديدة دقة أعلى ، وهي غير جراحية ، وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة. يمثل البروتوكول أداة جديدة لتشريح أدق للعمليات التي تنظم المراحل المبكرة من التلقيح.
Abstract
يتطلب التكاثر الجنسي في النباتات المزهرة تفاعلا أوليا بين حبوب اللقاح وسطح الوصمة ، حيث يتم إنشاء حوار جزيئي بين الشركاء المتفاعلين. كشفت الدراسات عبر مجموعة من الأنواع أن سلسلة من نقاط التفتيش الجزيئية تنظم تفاعل حبوب اللقاح والوصمة لضمان نجاح حبوب اللقاح المتوافقة بشكل عام في إحداث الإخصاب. في الأنواع التي تمتلك "وصمة عار جافة" ، مثل النبات النموذجي Arabidopsis thaliana ، فإن أول نقطة تفتيش للتوافق قبل الزيجوت بعد التلقيح هي إنشاء ترطيب حبوب اللقاح.
يتم تنظيم هذه المرحلة من التلقيح بإحكام ، حيث تثير الإشارات من حبوب اللقاح إطلاق الماء من وصمة العار ، مما يسمح بترطيب حبوب اللقاح. تعد القدرة على قياس وتتبع ترطيب حبوب اللقاح بدقة بمرور الوقت أمرا أساسيا لتصميم التجارب الموجهة لفهم تنظيم هذه الخطوة الحاسمة في التكاثر. تستخدم البروتوكولات المنشورة في كثير من الأحيان الزهور التي تم استئصالها من النبات الأم ، والحفاظ عليها على وسائط سائلة أو صلبة ، وتلقيح بكميات كبيرة.
تصف هذه الورقة مقايسة حيوية غير جراحية للتلقيح في الجسم الحي تسمح بتتبع الترطيب دقيقة بدقيقة لحبوب لقاح A. thaliana الفردية بدقة عالية. الفحص قابل للتكرار بدرجة كبيرة ، وقادر على اكتشاف الاختلافات الدقيقة جدا في ملامح ترطيب حبوب اللقاح ، وبالتالي فهو مناسب لتحليل الطفرات التي تؤثر على المسارات التي تنظم التلقيح. على الرغم من أن البروتوكول أطول من تلك الموصوفة للتلقيح السائب ، إلا أن الدقة والتكرار الذي يوفره ، إلى جانب طبيعته في الجسم الحي ، يجعله مثاليا للتشريح التفصيلي للأنماط الظاهرية للتلقيح.
Introduction
يعتمد التكاثر الجنسي الناجح في كاسيات البذور عادة على نقل حبوب اللقاح غير المحددة من العضو الآخر إلى وصمة العار ، إما داخل الأفراد أو بينهم (أي التلقيح). عادة ما يتم نقل حبوب اللقاح إلى زهرة متقبلة بوساطة الملقحات أو العوامل اللاأحيائية. على هذا النحو ، يؤدي هذا أيضا في كثير من الأحيان إلى ترسب حبوب اللقاح غير المتجانسة في ظل الظروف الطبيعية. مع استثناءات قليلة ، فإن تطور التلقيح بواسطة حبوب اللقاح غير المتجانسة غير مؤات من الناحية التطورية ، مما يقلل من اللياقة الإنجابية من خلال فرص التزاوج المفقودة ، مع فشل معظم النسل الهجين الناتج في التطور بشكل مناسب أو كونه عقيما1. وهكذا ، تطورت الآليات لمنع التلقيح بواسطة حبوب اللقاح غير المتجانسة "غير المتوافقة"2. لذلك يمكن القول إن التعرف السريع على حبوب اللقاح المتوافقة هو أهم عملية في المراحل المبكرة من التكاثر الجنسي في العديد من النباتات المزهرة.
في عائلة Brassicaceae ، حيث تكون الوصمات من النوع "الجاف" ، تعمل سلسلة من نقاط التفتيش الجزيئية في مراحل متعددة في عملية التكاثر التي تنظم التلقيح ، بحيث تنجح حبوب اللقاح المتوافقة فقط. تعد إماهة حبوب اللقاح واحدة من أهم نقاط التفتيش (الشكل 1)؛ لأن حبوب اللقاح التي تفشل في الترطيب لا يمكنها التقدم لإنتاج أنبوب حبوب اللقاح ومن ثم توصيل الحيوانات المنوية إلى النبات المشيجي الأنثوي. في كثير من الأحيان ، تفشل الحبوب غير المتوافقة في اجتياز نقطة تفتيش التلقيح الأولى هذه ، وبالتالي لا تحصل على مياه وصمة العار3. بين أفراد عائلة Brassicaceae ، يحدث التعرف على حبوب اللقاح بسرعة ، مع التوافق الذي يتم إنشاؤه في غضون دقائق من ارتباط حبوب اللقاح بالمدقة 4,5. في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير ، وبدأنا الآن في فهم الآليات الجزيئية التي تنظم نقاط تفتيش التلقيح الرئيسية.
الشكل 1: نظرة عامة على الأحداث الرئيسية أثناء التلقيح المتوافق. هذه المراحل ، مثل ترطيب حبوب اللقاح وإنبات أنبوب حبوب اللقاح ، هي أيضا "نقاط تفتيش" للتلقيح يجب التنقل فيها بنجاح لإحداث تلقيح متوافق. يمثل الرسم البياني وصمة عار من النوع "الجاف" ، وهي نموذجية للأنواع من عائلة Brassicaceae 2,20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أنشأت الأبحاث الرائدة حول نظام عدم التوافق الذاتي في براسيكا (SI) ، حيث يتم التعرف على حبوب اللقاح "الذاتية" ورفضها ، نموذجا للتعرف على وصمة العار في Brassicaceae6،7،8،9،10. يتم التوسط في SI في براسيكا وأقاربها بواسطة بروتينات "التعرف" الموجودة على سطح حبوب اللقاح وفي غشاء البلازما الموصوم الذي يؤدي ، عند التفاعل ، إلى رفض حبوب اللقاح. يعمل رفض حبوب اللقاح SI عن طريق تعطيل نظام التوافق مع وصمة اللقاح القاعدية والذي ، عند تنشيطه بالكامل من خلال تصور حبوب اللقاح المتوافقة ، يؤدي إلى إفراز مستهدف بواسطة وصمة العار ، وبالتالي يؤدي إلى ترطيب حبوب اللقاح (لمراجعات آلية توافق حبوب اللقاح ، انظر11،12). في مثال SI ، فإن الرباط الذي يحمله حبوب اللقاح هو بروتين صغير غني بالسيستين ، S-locus cysteine غني (SCR / SP11) ، والمستقبل الموصوم هو مستقبل S-locus kinase (SRK).
في الآونة الأخيرة ، في Arabidopsis thaliana ، تم العثور على مجموعة أخرى من البروتينات الصغيرة الغنية بحبوب اللقاح الغنية بالسيستين ، فئة بروتين معطف حبوب اللقاح Bs (فيPCP-Bs) ، لتكون منظمات مهمة لقبول حبوب اللقاح من خلال تنشيط ترطيب حبوب اللقاح13. كما تم وصف مستقبلات وصمة العار فيPCP-Bs وجوانب المسار التنظيمي النهائي مؤخرا14,15. ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسات الطفرية للجينات التي تشفر وسطاء الإشارات المحتملة التي تنقلها حبوب اللقاح والوصمة لترطيب حبوب اللقاح (بما في ذلك فيPCP-Bs) قد فشلت في توليد نباتات لها كتلة كاملة لنقطة تفتيش ترطيب حبوب اللقاح. يشير هذا بقوة إلى أن العديد من العوامل الأخرى ، التي لم يتم اكتشافها بعد ، تلعب دورا في تنظيم ترطيب حبوب اللقاح. بناء على الطريقة التي وصفها Wang et al.13 لأول مرة ، نصف هنا مقايسة حيوية محسنة عالية الدقة في الجسم الحي مناسبة لتحديد عيوب ترطيب حبوب اللقاح الدقيقة في خطوط A. thaliana الطافرة المرشحة.
Protocol
1. نمو النبات وإعداد الزهور
- قم بتقسيم بذور A. thaliana إلى طبقات في 0.1 ٪ من الأغاروز أو الماء المعقم لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية ، أو كبذور جافة لمدة 16-24 ساعة عند -20 درجة مئوية (uNASC ، اتصال شخصي).
- انقل البذور الطبقية إلى أواني السماد وضعها في غرفة نمو يتم التحكم فيها بيئيا. نشر النباتات مع 16: 8 ساعة ، الضوء: الفترة الضوئية الداكنة التي توفرها أنابيب الفلورسنت (130 μmol m-2 s-1). الحفاظ على درجة الحرارة عند 21 ± 2 درجة مئوية مع حوالي 40٪ رطوبة نسبية.
- تأكد من أن النباتات المانحة والمتلقية لحبوب اللقاح ، جنبا إلى جنب مع أي خطوط نباتية "تحكم" مناسبة أخرى ، تزرع معا لضمان الإزهار المتزامن. نشر النباتات لمدة 6 أسابيع تقريبا حتى تترسخ النورات.
- حدد براعم الزهور في المرحلة 12 على نبات مستلم حبوب اللقاح قبل يوم واحد من إجراء المقايسة الحيوية للإخصاء16،17 - هذه براعم زهور غير مفتوحة ستكمل فتح الزهرة وتفكك العضو الآخر في اليوم التالي18.
ملاحظة: تجنب الزهور الثلاثة الأولى المنتجة على الإزهار الرئيسي ، لأنها عادة ما تظهر سلوكا تناسليا غير عادي. إذا كان ذلك متاحا ومناسبا للدراسة ، استخدم خط نبات معقم للذكور ، مثل خط A. thaliana (الانضمام Col-0) pA9-barnase ، حيث تفشل الأنثرات في النضج19. - لإخصاء أزهار متلقي حبوب اللقاح ، ضع النبات في أصيصه على جانبه. قم بلصق جذع النبات ، في المنطقة القريبة من الزهور التي سيتم تخصيبها ، على شريحة زجاجية في موضعها تحت مجهر تشريح ستيريو.
- باستخدام زوج من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة ، قم بفتح برعم الزهرة بعناية وإزالة جميع بتلات الزهور والأنثرات. تأكد من أن المدقة غير تالفة وأن وصمة العار خالية من حبوب اللقاح الملوثة.
ملاحظة: لا تتطلب خطوط النباتات المعقمة الذكور الإخصاء. - أعد النباتات إلى غرفة النمو وتأكد من أن الأزهار المخصوبة لا تتلامس مع النباتات الأخرى أو الأجسام الغريبة.
2. الحصول على البيانات الخام لفحص ترطيب حبوب اللقاح
- في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة النباتات من غرفة النمو. ضع نبات متلقي حبوب اللقاح على جانبه وضع الزهرة على مرحلة المجهر المقلوب (الشكل 2) بحيث يمكن تصوير وصمة العار بوضوح.
- ثبت موضع الزهرة المراد تصويرها عن طريق تثبيت الجذع على شريحة زجاجية باستخدام شرائط من الشريط اللاصق. الحفاظ على درجة الحرارة بين 18 درجة مئوية و 25 درجة مئوية والرطوبة النسبية أقل من 60٪.
ملاحظة: بالنسبة لخط النبات المعقم للذكور pA9-barnase ، من الأفضل إجراء الفحص في الصباح عندما تفتح الأزهار ولا تعيق البتلات مجال الرؤية. - بعد ذلك ، قم بإزالة زهرة صحية ومفتوحة حديثا من النبات المانح لحبوب اللقاح. ضعه تحت مجهر تشريح واجمع بعض حبوب اللقاح على طرف ملقط نظيف ذو رؤوس دقيقة عن طريق لمس الأنثرات برفق (الشكل 3 أ). رمش المسجل على قضيب قصير هو أيضا أداة فعالة لجمع ونقل حبوب اللقاح (الشكل 3C).
- قم بإزالة حبوب اللقاح الزائدة من الملقط عن طريق لمسها برفق على بتلات الزهور حيث تم حصاد حبوب اللقاح ، حتى تتشكل طبقة أحادية من حبوب اللقاح عند طرف الملقط.
ملاحظة: طبقة أحادية من حبوب اللقاح على طرف ملقط ذو رؤوس دقيقة ستسهل بشكل كبير نقل حبة واحدة في الخطوات اللاحقة. من الممكن أيضا الحصول على حبة لقاح واحدة على الملقط بهذه التقنية (الفيديو التكميلي S1). - العودة إلى النبات المتلقي لحبوب اللقاح ، واستخدام عدسة موضوعية منخفضة الطاقة (على سبيل المثال ، عدسة موضوعية 10x ؛ الشكل 3 ب) ، ركز المجهر المقلوب على وصمة العار المراد تلقيحها.
- أمسك الملقط على طول الفتحة بين أذرع الملقط (الشكل 4) ، اقترب بعناية من خلية حليمة موصومة غير ملقحة ("عذراء").
ملاحظة: لقد وجدنا أن هذه الطريقة في الإمساك بالملقط تساعد على البراعة وتقلل من تأثير المصافحة. يمكن استخدام micromanipulator للمستخدمين الذين هم أقل خبرة أو يجدون صعوبة في تطبيق حبة لقاح واحدة بدقة باليد. - حدد حبوب اللقاح في وضع مناسب على الملقط لنقلها إلى وصمة العار. استمر في الاقتراب من خلية الحليمة الموصومة غير الملقحة حتى تتلامس حبوب اللقاح المختارة بالضوء مع سطحها. اسحب الملقط ببطء وتأكد من ارتباط حبوب اللقاح (الشكل 5).
ملاحظة: يوضح الفيديو التكميلي S1 والفيديو التكميلي S2 هذه الخطوة مع وجود حبوب اللقاح المفردة والمتعددة على الملقط. - تأكد من أن حبوب اللقاح موجهة بحيث يكون محورها الاستوائي مرئيا بوضوح وفي تركيز حاد. قم بالتبديل على الفور إلى عدسة موضوعية ذات طاقة أعلى (على سبيل المثال ، 20x) والتقط صورة لحبوب اللقاح. هذه الصورة الأولى هي T = 0. استمر في التقاط المزيد من الصور بفواصل زمنية مدتها 1 دقيقة بإجمالي 10 دقائق.
- اضبط التركيز حسب الضرورة لاستيعاب الحركات الصغيرة في حبوب اللقاح أو وصمة العار. سجل درجة الحرارة المحيطة والرطوبة النسبية للغرفة كل 2 دقيقة للسماح بإجراء مقارنات مستقبلية بين النسخ المتماثلة التجريبية.
- بمجرد التقاط جميع الصور ، احفظها بتنسيق غير ضياع ، مثل التنسيق الخاص بالشركة المصنعة أو بتنسيق TIFFs.
ملاحظة: سيكون هناك 11 صورة لكل عينة من حبوب اللقاح (الشكل التكميلي S1). تعد إعدادات الحصول على اللقطات المتتابعة آليا / يدويا في معظم برامج الحصول على الصور المسجلة الملكية ميزات مفيدة لتسهيل تنظيم كل سلسلة زمنية. - كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.9 للحصول على حبوب اللقاح الإضافية. الحصول على بيانات لأعداد شبه متكافئة من السيطرة (النوع البري [WT]) والتلقيح التجريبي.
الشكل 2: إعداد المعدات المستخدمة في المقايسة الحيوية لترطيب حبوب اللقاح. في هذا المثال ، كان خط النبات العقيم الذكري pA9-barnase هو متلقي حبوب اللقاح. تم وضع النبات ، داخل أصيصه ، على جانبه ، وتم لصق الجذع على شريحة زجاجية موضوعة على مسرح المجهر. لتقليل الضغط الميكانيكي والمساعدة في تحديد موضع المصنع ، تم استخدام منصة قابلة للتعديل لدعم وعاء النبات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جمع حبوب اللقاح من الزهرة المانحة لحبوب اللقاح. تظهر الصور استخدام (أ) ملقط رفيع الرأس و (ج) قطعة من رمش. يجب إزالة كتل حبوب اللقاح (السهم الأحمر) عن طريق لمسها برفق على بتلات الزهور المانحة حتى يتم الحصول على طبقة أحادية من حبوب اللقاح (السهم الأخضر). (ب) صورة عالية الدقة لوصمة عار الخط العقيم الذكري A. thaliana (Col-0) pA9-barnase غير الملقحة التي وصلت إلى مرحلة النمو المناسبة للمقايسة الحيوية لترطيب حبوب اللقاح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: طريقة الإمساك بالملقط عند نقل حبوب اللقاح إلى وصمة العار المتلقية. (أ) الاتجاه غير الصحيح للإمساك بالملقط؛ ب: الاتجاه الصحيح للإمساك بالملقط. يوفر تثبيت الملقط جانبا في هذا التكوين ، كما يتضح من موضع الإبهام بين أذرع الملقط ، ثباتا أكبر لتسهيل نقل حبوب اللقاح إلى الحليمات الموصومة غير الملقحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نقل حبة لقاح واحدة من طرف ملقط إلى خلية حليمة موصومة غير ملقحة ("عذراء") لنبات عقيم ذكر pA9-barnase. أ: الاقتراب الحذر من الخلية الحليمية. ب: ربط حبة اللقاح الموضوعة بشكل مناسب (السهم الأزرق) بخلية الحليمة (السهم البرتقالي). ج: سحب الملقط والتأكيد البصري لارتباط حبوب اللقاح (السهم الأرجواني). تم تصوير اللوحات A-C بعدسة موضوعية 10x (مسافة عمل 10.5 مم ؛ فتحة رقمية 0.25) وهي لقطات مشتقة من مقطع الفيديو المقدم في الفيديو التكميلي S1. (D) الانتقال إلى عدسة موضوعية بمعدل 20 ضعفا (مسافة عمل 2.1 مم؛ فتحة عدسة رقمية 0.5) لبدء التقاط الصور في سلسلة زمنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. قياسات مقايسة ترطيب حبوب اللقاح
- حدد معدل ترطيب حبوب اللقاح على أنه التغير في طول المحور شبه الثانوي (الشكل 6) لحبوب اللقاح (أي نصف القطر الاستوائي) بمرور الوقت وقدمه كنسبة مئوية للتغير (المعادلة [1]):
(1) - باستخدام برنامج تحليل الصور ، سجل قيم المحور شبه الثانوي لكل حبة حبوب اللقاح في السلسلة التجريبية.
ملاحظة: يعتمد اسم خيار القياس هذا على البرامج، مثل "القطع الناقص المستدير" أو "القطع الناقص المكون من 5 نقاط". - كرر الخطوات 3.1-3.2 لجميع حبوب اللقاح الأخرى المراد قياسها. من أجل الاتساق ، قم بتطبيق نفس الدرجة من التكبير الرقمي ونفس النهج لتحديد "حدود حبوب اللقاح" لجميع القياسات في مجموعات البيانات.
- بمجرد اكتمال جميع القياسات لسلسلة زمنية، قم بتصدير قيم المحور شبه الثانوي الخام لكل مكدس صور إلى جدول بيانات وقدم البيانات في أعمدة لكل مكدس صور. ضمان إدراج بيانات من 15 حبة لقاح رطبة على الأقل في التحليل لكل خط نبات (الجدول التكميلي S1).
- ليس من غير المعتاد أن يفشل عدد صغير من حبوب اللقاح في الترطيب أو الترطيب بشكل أبطأ بكثير مما كان متوقعا. قد تكون هذه الحبوب "الفاشلة" نتيجة لضعف الاتصال بين الحبوب وخلية الحليمة أو تتعلق بصلاحية حبوب اللقاح. ابحث عن هذه واستبعدها من مجموعة البيانات ما لم تكن مطلوبة في تصميمها التجريبي.
- احسب القيم المتوسطة لكل نقطة زمنية لكل خط نبات. استخدم اختبارات t غير المقترنة و ANOVA أحادية الاتجاه للتحليل الإحصائي لبيانات الترطيب من WT والخطوط الطافرة في كل نقطة زمنية. استخدم اختبار t متعدد للمقارنة المتزامنة للوسائل بين WT والخطوط الطافرة عبر نقاط زمنية متعددة.
ملاحظة: تعد مخططات XY مفيدة جدا أيضا لتصور الاتجاه العام لترطيب حبوب اللقاح بين خطوط النبات التي تتم مقارنتها.
(1)
الشكل 6: حبوب اللقاح WT ترطب على خلية حليمة وصمة العار من A. thaliana (Col-0 ؛ pA9-barnase خط عقيم للذكور). (أ) النقطة الزمنية صفر و 0 (0 MAP) و (ب) 10 MAP. الدائرة الحمراء حول حبوب اللقاح هي "حدود حبوب اللقاح" التي يحددها ويرسمها المشغل باستخدام برنامج تحليل الصور. تمثل الخطوط الخضراء والحمراء الداكنة داخل حبوب اللقاح المحاور شبه الرئيسية وشبه الثانوية ، على التوالي. يستخدم طول المحور شبه الثانوي لحساب درجة ترطيب حبوب اللقاح. ويمكن الاطلاع على سلسلة زمنية كاملة لمجموعة البيانات هذه في الشكل التكميلي S1. تم التقاط الصورة بعدسة موضوعية 20x (مسافة عمل 2.1 مم ؛ فتحة عدسة رقمية 0.5). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: MAP = الحد الأدنى بعد التلقيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
يقدم هذا القسم مجموعتين من أمثلة بيانات ترطيب حبوب اللقاح ، التي تم جمعها كما هو موضح أعلاه ، ل A. thaliana. تتكون المجموعة الأولى من البيانات من ثلاث نسخ مكررة من سلسلة زمنية لترطيب حبوب اللقاح لنباتات WT ، مع جمع كل نسخة مكررة في يوم مختلف. يحتوي كل مكرر على ما لا يقل عن 18 قيمة فردية لحبوب اللقاح ، بإجمالي 55 حبة لقاح عبر جميع النسخ الثلاثة. كانت القيم الدنيا والقصوى للوسائل بين النسخ المتماثلة ، لجميع النقاط الزمنية ، في حدود 3٪ (الشكل 7 والجدول التكميلي S1). توضح هذه البيانات التمثيلية لتلقيح WT بوضوح الدرجة العالية من الاتساق التي يمكن الحصول عليها باستخدام المنهجية المفصلة هنا لأعداد العينات المنخفضة نسبيا وعبر أيام مختلفة.
الشكل 7: مخطط XY يوضح اتساق ملامح ترطيب حبوب اللقاح من النوع البري A. thaliana على مدى فترة زمنية مدتها 10 دقائق. كان أصل حبوب اللقاح هو انضمام Col-0 ل A. thaliana وكان والد المدقة هو خط A . thaliana (Col-0) العقيم للذكور pA9-barnase. تمثل البيانات ثلاث مجموعات بيانات مستقلة تم جمعها في أيام مختلفة وتظهر درجة عالية من الاتساق. ويرد في الشكل التكميلي S2 رسم بياني مربع وشارب وتحليل إحصائي لوسائل مجموعات البيانات هذه. يتم عرض عدد حبوب اللقاح المقاسة ('n') لكل مجموعة بيانات مستقلة بجوار بناء الجملة (WT1 / WT2 / WT3) على الشكل. اختصار: WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الحصول على المجموعة الثانية من البيانات لخط نبات يؤوي إدخال T-DNA في جين تشفير بروتين غلاف حبوب اللقاح الذي يولد طفرة "ضربة قاضية" ، يشار إليها هنا باسم "KD mutant". تم ترسيب حبوب اللقاح الطافرة في وصمات العقم الذكرية pA9-barnase من أجل التنميط المائي ، كما هو موضح في البروتوكول. كما يتضح من البيانات الناتجة (الشكل 8) ، كان لحبوب اللقاح الطافرة و WT ملامح ترطيب لا يمكن تمييزها خلال أول 5 دقائق. ومع ذلك ، بعد 5-10 دقائق من التلقيح (MAP) ، بدأ متوسط تغيير المحور شبه الثانوي لحبوب اللقاح الطافرة في الانخفاض عن حبوب اللقاح WT ، حيث أصبح الفرق ذا دلالة إحصائية عند 10 MAP. لا توضح هذه النتيجة فقط أن بروتين غلاف حبوب اللقاح هذا له دور في التوسط في ترطيب حبوب اللقاح ، ولكنه يوضح أيضا بشكل جيد فائدة هذا الاختبار الحيوي عالي الدقة أحادي الحبة لتتبع ترطيب حبوب اللقاح. في هذا المثال بالذات ، كانت حساسيته قادرة على اكتشاف التأثير الخفي ل "ضربة قاضية" لجين تشفير بروتين معطف حبوب اللقاح.
الشكل 8: ملامح ترطيب حبوب اللقاح ل WT وخط طافر بروتين معطف حبوب اللقاح "بالضربة القاضية" (KD mutant). (أ) ملامح الترطيب على مدى فترة زمنية مدتها 10 دقائق ل WT وحبوب اللقاح الطافرة. كان والدا حبوب اللقاح هما انضمام Col-0 ل A. thaliana وبروتين معطف حبوب اللقاح KD الطافر (أيضا في خلفية Col-0). في كلتا الحالتين ، كان والد المدقة هو خط AA9-barnase العقيم A. thaliana (Col-0). (ب) مخططات صندوقية وشاربة توضح مدى ترطيب حبوب اللقاح (من حيث النسبة المئوية للتغير في المحور شبه الثانوي) عند 5 MAP و 10 MAP لمجموعات بيانات WT وحبوب اللقاح الطافرة. تمثل الشعيرات عينة القيم الدنيا والقصوى. تصور المربعات الربع الأدنى والوسيط والربع العلوي لمجموعة البيانات. تمثل الصلبان البيضاء متوسط مجموعة البيانات. يظهر تحليل اختبار t غير المزاوج أن متوسط النسبة المئوية لترطيب حبوب اللقاح يختلف اختلافا كبيرا بين خطي النبات عند 10 MAP. تشير علامة النجمة الواحدة إلى p < 0.05 (اختبار t غير المقترن). الاختصارات: WT = النوع البري ؛ دينار كويتي = ضربة قاضية ؛ MAP = الحد الأدنى بعد التلقيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: سلسلة زمنية للمقايسة الحيوية لترطيب حبوب اللقاح المقصوصة لحبوب لقاح WT التي ترطب على خلية حليمة وصمة عار من نبات معقم ذكر pA9-barnase على مدار 10 دقائق. تم التقاط الصور على فترات 1 دقيقة. تم استخدام الصور في 0 MAP و 10 MAP في الشكل 6 (مرفق بشكل منفصل). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: WT = النوع البري ؛ MAP = الحد الأدنى بعد التلقيح. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: مخطط صندوقي وشارب يوضح مدى ترطيب حبوب اللقاح (من حيث النسبة المئوية للتغير في المحور شبه الثانوي) خلال فترة زمنية مدتها 10 دقائق لمجموعات بيانات حبوب اللقاح الثلاثة WT الموصوفة في الشكل 7. كان والد المدقة هو خط A. thaliana (Col-0) العقيم للذكور pA9-barnase. تمثل الشعيرات عينة القيم الدنيا والقصوى. تصور المربعات الربع السفلي (المفصلة السفلية) والوسيط (المفصلة الوسطى) والربع العلوي (المفصلة العلوية) لمجموعة البيانات. يتم عرض نقاط البيانات الفردية. يظهر ANOVA أحادي الاتجاه أن متوسط النسبة المئوية لقيم ترطيب حبوب اللقاح بين مجموعات البيانات الثلاث لم تكن مختلفة إحصائيا عن بعضها البعض طوال فترة زمنية مدتها 10 دقائق. العتبة الهامة هي p < 0.05 (ANOVA أحادي الاتجاه). اختصار: WT = النوع البري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S1: بيانات ترطيب حبوب اللقاح الخام المستخدمة لبناء الشكل 7 (حبوب اللقاح A. thaliana WT Col-0 على وصمة العصم العقيمة للذكور pA9-barnase). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الفيديو التكميلي S1: مقطع فيديو يوضح نقل حبة لقاح واحدة من WT (انضمام Col-0) على طرف زوج من الملقط إلى خلية حليمة موصومة "عذراء" (خط عقيم ذكوري pA9-barnase). لتسهيل إمكانية الوصول إلى الفيديو ، تم تخفيض جودة الصورة عن قصد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الفيديو التكميلي S2: مقطع فيديو يوضح نقل حبوب لقاح WT واحدة (انضمام Col-0) من طبقة أحادية من حبوب اللقاح عند طرف زوج من الملقط إلى خلية حليمة "عذراء" (خط عقيم ذكوري pA9-barnase). لتسهيل إمكانية الوصول إلى الفيديو ، تم تخفيض جودة الصورة عن قصد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
بالنسبة للنباتات المزهرة ، يمكن القول إن المراحل المبكرة جدا من التكاثر الجنسي هي الأكثر أهمية. على مستوى تفاعل حبوب اللقاح والوصمة ، يتم اتخاذ القرارات الجزيئية التي تحدد "توافق" الشركاء المتفاعلين. مثل هذه القرارات ، إذا تم اتخاذها بشكل صحيح ، تتجنب إهدار الموارد التي يمكن أن تؤثر على اللياقة الإنجابية21. وبالتالي ، فإن السماح لحبوب اللقاح المتوافقة فقط بإحداث الإخصاب هو أحد المكونات المهمة للحفاظ على الأنماط الجينية المتكيفة جيدا ، وبالتالي النجاح التطوري للأنواع. كانت الأبحاث التي أجريت مع المصنع النموذجي A. thaliana قيمة للغاية في تعميق فهمنا لهذه العملية. كشف عدد من الدراسات على مدى العقود القليلة الماضية عن وجود عوامل في غلاف حبوب اللقاح تعمل عند "نقطة تفتيش" التوافق الأولى ، حيث تحصل حبوب اللقاح على مياه وصمة العار للسماح بترطيب حبوب اللقاح13. على الرغم من هذه الأفكار الأولية حول الآليات التي تنظم التوافق بين حبوب اللقاح ووصمة العار ، لا تزال هناك العديد من الثغرات في فهمنا لهذه العملية. حتى الآن ، لا يمكن لأي طفرات من الروابط التي تنقلها حبوب اللقاح أو المستقبلات الموصومة المعروفة بتأثيرها على ترطيب حبوب اللقاح أن تمنع تماما التلقيح المتوافق ، مما يشير إلى وجود محددات أخرى غير مكتشفة لترطيب حبوب اللقاح. من خلال القدرة على مراقبة النمط الظاهري محل الاهتمام بسهولة ، فإن المقايسة الحيوية لترطيب حبوب اللقاح الموصوفة هنا هي واحدة من أكثر التقنيات المباشرة لدراسة الطفرات المحتملة التي تنظم التلقيح.
عادة ما تستخدم المنهجيات الحالية لقياس ترطيب حبوب اللقاح التلقيح السائب وتبلغ عن نقاط زمنية أقل14،22،23 ، وبالتالي قد تفوت الأنماط الظاهرية الدقيقة المهمة لملف تعريف الترطيب. على سبيل المثال ، كشفت الدراسة التي أجراها Wang et al.13 ، جنبا إلى جنب مع العمل على طفرات بروتين معطف حبوب اللقاح الأخرى في مختبرنا (ملاحظات غير منشورة) ، عن اختلافات مثيرة للاهتمام في ملامح الترطيب بين الطفرات. قد تحمل هذه الاختلافات الدقيقة أدلة مهمة على الآليات التنظيمية الكامنة وراء التلقيح المتوافق.
تركز الطريقة الموصوفة هنا على الحصول على أعداد صغيرة نسبيا من القياس بين خطوط النباتات الطافرة و WT ، مع التركيز على الدقة المنهجية لتقليل التباين داخل مجموعات البيانات. في حين أن هذه الطريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة (كما هو موضح في الشكل 7) ، بافتراض أن درجة الحرارة والرطوبة يتم التحكم فيها بشكل كاف ، فمن المهم جمع بيانات الترطيب لأعداد متساوية تقريبا من WT وحبوب اللقاح الطافرة في نفس اليوم لتقليل احتمالية التباين. يمكن بعد ذلك تجميع البيانات عبر أيام مختلفة إذا لزم الأمر. بالإضافة إلى ذلك ، يعد اختيار محطات التحكم في WT المناسبة أمرا حيويا للتفسير الصحيح لنتائج الترطيب. بالنسبة لمتلقي حبوب اللقاح ، يجب استخدام نفس خط النبات لتلقي كل من التحكم في WT وحبوب اللقاح الطافرة.
على سبيل المثال ، نستخدم خط النبات المعقم الذكري pA9-barnase ، والذي يظهر أيضا في بروتوكول الفيديو ، كمتلقي حبوب اللقاح لكل من حبوب اللقاح WT (التحكم) وحبوب اللقاح الطافرة (التجريبية) عند التحقيق في خطوط طفرة حبوب اللقاح T-DNA (مثل الطافر "KD" الموصوف في الشكل 8). يجب تجنب خلط البيانات من مثل هذا الخط العقيم للذكور ، والذي لا يحتاج إلى إخصاء ، مع تلك التي تم جمعها من خط التحكم الذي تم إخصاؤه يدويا لأن هذه الوصمات من المحتمل أن تتصرف بشكل مختلف. وبالمثل ، يجب استخدام خطوط متحولة ضعيفة جنبا إلى جنب مع خط WT (تحكم) ضعيف كلما أمكن ذلك. يجب أيضا تطبيق نفس الحذر عند النظر في الخلفية الوراثية للنباتات قيد الدراسة. في حين تم إنشاء مجموعات T-DNA الطافرة الأكثر شيوعا في خلفية Col-0 ، فإن مجموعات أخرى ، مثل مجموعة FLAG من المعهد الوطني للبحوث الزراعية (INRA) ، متوفرة في الخلفية الجينية Wassilewskija (WS)24,25. في مثل هذه الحالات ، ينصح باستخدام خطوط نبات WT الخاصة بالنمط البيئي المعني كعناصر تحكم.
على الرغم من أننا ركزنا هنا على ترطيب حبوب اللقاح خلال أول 10 دقائق من تفاعل حبوب اللقاح ووصمة العار ، إلا أنه يمكن أيضا تكييف هذه الطريقة لتشمل ملفات تعريف الترطيب التي تغطي فترة زمنية أطول. من السمات الرئيسية للبروتوكول أن الزهور تظل مرتبطة بالبروتوكولات المنشورة لتيار النبات الأم تتطلب عادة استئصال المدقة ووضعها في الوسائط للحفاظ على الأنسجة طوال مدة التجربة14،18،26. على الرغم من عدم وجود دليل مباشر يشير إلى أن مثل هذا النهج شبه الحي يؤثر على ترطيب حبوب اللقاح أو يغير بالفعل التنظيم في الجسم الحي لهذه العملية ، فمن المتصور أن استئصال الزهور من النبات الأم يمكن أن يؤثر على التلقيح. وبالتالي ، يحقق هذا البروتوكول بيئة حقيقية في الجسم الحي لدراسة تفاعل حبوب اللقاح والوصمة ، حيث يتم الحفاظ على السلامة الهيكلية للنبات.
يمكن القول إن نقل حبوب اللقاح المفردة إلى الحليمات "البكر" هي واحدة من أكثر العمليات تحديا الموصوفة في هذا البروتوكول. ليس من غير المألوف نقل مجموعات من حبوب اللقاح عن طريق الخطأ. ومع ذلك ، يمكن تقليل فرصة حدوث ذلك بشكل كبير من خلال ضمان وجود طبقة أحادية فقط من حبوب اللقاح على الملقط (الشكل 3 أ) (أو حتى حبة لقاح واحدة فقط ؛ الشكل 5) ، و / أو باستخدام حبوب اللقاح الموجهة بالفعل ، بحيث "تبرز" من الآخرين على طرف الملقط. لقد وجدنا أن المشغل المتمرس يمكنه إكمال نقل حبوب اللقاح الواحدة بنجاح إلى خلية حليمة موصومة في حوالي 3 دقائق وتسجيل البيانات لما يصل إلى خمس حبوب لقاح خلال فترة 1 ساعة. وبالتالي ، على مدى فترة 2-4 أيام ، يمكن تجميع بيانات كافية لإجراء تحليل إحصائي ذي مغزى لخطوط النبات قيد الدراسة.
من المحتمل أن يكون الخطأ البشري أكبر مصدر للتباين في تحليل مجموعات البيانات المستمدة من الدراسات التي تستخدم هذا البروتوكول. على سبيل المثال ، يعود تعريف "حدود حبوب اللقاح" أثناء تحليل الصور إلى حكم الباحث الفردي. وبالتالي ، هناك احتمال أن القياسات التي أجراها باحثون مختلفون ، حتى على نفس مجموعة البيانات ، قد تولد تباينا. حيثما أمكن ، يجب على باحث واحد إجراء القياسات لتقليل أخطاء أخذ العينات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اقتران تحليل WT ومجموعات البيانات الطافرة من قبل نفس المشغل ينفي التعريف الذاتي المحتمل ل "حدود حبوب اللقاح" والاختلاف بين المشغلين.
في الختام ، تم وصف طريقة متطورة ودقيقة لقياس ملامح ترطيب حبوب اللقاح في الكائن الحي النموذجي A. thaliana. لقد أثبتنا أنه من خلال استخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحصول بسهولة على بيانات ترطيب حبوب اللقاح المتسقة للغاية ل A. thaliana. أظهرت ثلاث دفعات مستقلة من البيانات الخاصة بتلقيح WT التي تم الحصول عليها في أيام مختلفة انحرافات صغيرة ثابتة بنسبة <3٪ عبر جميع النقاط الزمنية (الشكل 7 والجدول التكميلي S1). على الرغم من أن المقايسة الحيوية المقدمة هنا أكثر تعقيدا قليلا من معظم البروتوكولات الحالية ، إلا أن دقة البيانات المتولدة متفوقة ومناسبة لتحديد وتوصيف الطفرات الجديدة التي تؤثر على المسارات التي تنظم التلقيح المتوافق.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل جامعة باث (جامعة باث ، باث ، المملكة المتحدة ، BA2 7AY) منح الدراسات العليا إلى Y.-L.L. و L.W. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
- Rieseberg, L. H., Willis, J. H.
- Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
- Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
- Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
- Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
- Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
- Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
- Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
- Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
- Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
- Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
- Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279 (2022).
- Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
- Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
- Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684 (2022).
- Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140 (2020).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
- Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
- Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282 (2020).
- Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
- Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228 (2016).
- Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
- O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
- Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
- Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549 (2019).
