Summary
Um método aprimorado para medir o perfil de hidratação polínica em Arabidopsis thaliana é descrito aqui. O novo método oferece maior resolução, não é invasivo e é altamente reprodutível. O protocolo representa uma nova ferramenta para uma dissecação mais fina dos processos que regulam os estágios iniciais da polinização.
Abstract
A reprodução sexuada em plantas com flores requer interação inicial entre o grão de pólen e a superfície estigmatizada, onde um diálogo molecular é estabelecido entre os parceiros que interagem. Estudos em uma variedade de espécies revelaram que uma série de pontos de verificação moleculares regulam a interação pólen-estigma para garantir que apenas pólen compatível, geralmente intraespecífico, seja bem-sucedido na fertilização. Em espécies que possuem um "estigma seco", como a planta-modelo Arabidopsis thaliana, o primeiro ponto de verificação de compatibilidade pré-zigótica pós-polinização é o estabelecimento da hidratação polínica.
Esta fase da polinização é fortemente regulada, em que os sinais do grão de pólen provocam a liberação de água do estigma, permitindo assim a hidratação do pólen. A capacidade de medir e rastrear com precisão a hidratação do pólen ao longo do tempo é a chave para o planejamento de experimentos direcionados à compreensão da regulação dessa etapa crítica da reprodução. Os protocolos publicados frequentemente utilizam flores que foram excisadas da planta mãe, mantidas em meio líquido ou sólido e polinizadas em massa.
Este trabalho descreve um bioensaio de polinização in vivo não invasivo que permite o rastreamento minuto a minuto da hidratação de grãos de pólen individuais de A. thaliana em alta resolução. O ensaio é altamente reprodutível, capaz de detectar variações muito sutis dos perfis de hidratação polínica e, portanto, é adequado para a análise de mutantes que afetam as vias reguladoras da polinização. Embora o protocolo seja mais extenso do que os descritos para polinizações em massa, a precisão e a reprodutibilidade que ele proporciona, juntamente com sua natureza in vivo , o tornam ideal para a dissecção detalhada dos fenótipos de polinização.
Introduction
A reprodução sexuada bem-sucedida em angiospermas normalmente depende da transferência de grãos de pólen intraespecíficos da antera para o estigma, dentro ou entre indivíduos (ou seja, polinização). Essa transferência de grãos de pólen para uma flor receptiva é geralmente mediada por polinizadores ou fatores abióticos; Como tal, isso também resulta frequentemente na deposição de pólen heteroespecífico sob condições naturais. Com algumas exceções, a progressão da polinização por pólen heteroespecífico é evolutivamente desvantajosa, reduzindo a aptidão reprodutiva através da perda de oportunidades de acasalamento, com a maioria das progênies híbridas resultantes não se desenvolvendo adequadamente ou sendo estéril1. Assim, mecanismos têm evoluído para bloquear a polinização por pólen heteroespecífico "incompatível"2. O rápido reconhecimento de pólen compatível é, portanto, sem dúvida, o processo mais importante nos estágios iniciais da reprodução sexuada em muitas plantas com flores.
Na família Brassicaceae, onde os estigmas são do tipo "seco", uma série de checkpoints moleculares atuam em múltiplos estágios do processo reprodutivo regulando a polinização, de modo que apenas o pólen compatível é bem-sucedido. A hidratação polínica é um dos pontos de verificação mais importantes (Figura 1), pois o pólen que não se hidrata não consegue progredir para produzir um tubo polínico e, posteriormente, entregar espermatozoides ao gametófito feminino. Frequentemente, grãos incompatíveis não conseguem passar por esse primeiro ponto de verificação de polinização e, portanto, não têm acesso à água estigmatizada3. Entre os membros da família Brassicaceae, o reconhecimento do pólen ocorre rapidamente, sendo a compatibilidade estabelecida poucos minutos após a fixação do grão de pólen ao pistilo 4,5. Nos últimos anos, muito progresso foi feito, e agora estamos começando a entender os mecanismos moleculares que regulam os principais pontos de controle de polinização.
Figura 1: Visão geral dos principais eventos durante a polinização compatível. Essas etapas, como a hidratação do pólen e a germinação do tubo polínico, também são "pontos de verificação" de polinização que devem ser navegados com sucesso para efetuar uma polinização compatível. O diagrama representa um estigma do tipo "seco", típico de espécies da família Brassicaceae 2,20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Pesquisas pioneiras sobre o sistema de autoincompatibilidade (SI) de Brassica, onde o pólen "próprio" é reconhecido e rejeitado, estabeleceram o paradigma para o reconhecimento do estigma polínico em Brassicaceae 6,7,8,9,10. O SI em Brassica e seus parentes é mediado por proteínas de "reconhecimento" que residem na superfície do pólen e na membrana plasmática estigmatizada que, ao interagir, levam à rejeição do pólen. A rejeição de pólen SI opera pela ruptura do sistema de compatibilidade pólen-estigma basal que, quando totalmente ativado pela percepção de pólen compatível, leva à secreção direcionada pelo estigma, impulsionando assim a hidratação do pólen (para revisões do mecanismo de compatibilidade polínica, ver11,12). No exemplo do SI, o ligante transmitido por pólen é uma pequena proteína rica em cisteína, rica em cisteína do locus S (SCR/SP11), e o receptor estigmatizado é a quinase do receptor do locus S (SRK).
Recentemente, em Arabidopsis thaliana, outro grupo de pequenas proteínas ricas em cisteína, as proteínas polínicas classe B (AtPCP-Bs), tem se mostrado importante regulador da aceitação do pólen por meio da ativação da hidratação polínica13. Receptores estigmatizados da AtPCP-Bs e aspectos da via regulatória a jusante também foram recentemente descritos14,15. Curiosamente, estudos mutacionais de genes que codificam potenciais mediadores de sinalização estigmatizados e transmitidos por pólen da hidratação polínica (incluindo PCP-Bs) falharam em gerar plantas que têm um bloqueio completo ao ponto de verificação de hidratação polínica. Isso sugere fortemente que vários outros fatores, ainda não descobertos, desempenham um papel na regulação da hidratação do pólen. Com base no método descrito pela primeira vez por Wang et al.13, descrevemos aqui um bioensaio in vivo de alta resolução aprimorado adequado para a identificação de defeitos sutis de hidratação de pólen em linhagens candidatas a mutação de A. thaliana.
Protocol
1. Crescimento das plantas e preparo das flores
- Estratificar sementes de A. thaliana em agarose 0,1% ou água estéril por 3 dias a 4 °C, ou como sementes secas por 16-24 h a -20 °C (uNASC, comunicação pessoal).
- Transfira as sementes estratificadas para vasos de composto e coloque em uma câmara de crescimento ambientalmente controlada. Propagar plantas com fotoperíodo claro:escuro de 16:8 h, proporcionado por tubos fluorescentes (130 μmol m-2 s-1). Manter a temperatura em 21 ± 2 °C com aproximadamente 40% de umidade relativa.
- Garantir que as plantas doadoras e receptoras de pólen, juntamente com quaisquer outras linhas de plantas de "controle" apropriadas, sejam semeadas juntas para garantir uma floração síncrona. Propagar as plantas por aproximadamente 6 semanas até que as inflorescências estejam bem estabelecidas.
- Selecionar botões florais do estágio 12 na planta receptora de pólen 1 dia antes da realização do bioensaio para emasculação 16,17 – são botões florais fechados que completarão a abertura da flor e a deiscência da antera no dia seguinte18.
NOTA: Evite as três primeiras flores produzidas na inflorescência principal, pois estas tipicamente apresentam comportamento reprodutivo incomum. Se disponível e apropriado para o estudo, utilizar uma linhagem de planta macho estéril, como a linhagem pA9-barnase de A. thaliana (acesso Col-0), onde as anteras não amadurecem19. - Para emascular as flores do receptor de pólen, coloque a planta, em seu vaso, de lado. Tape o caule da planta, na região próxima às flores que serão emasculadas, para uma lâmina de vidro que fica em posição sob um microscópio dissecante estéreo.
- Usando um par de pinças de ponta fina, abra cuidadosamente o botão da flor e remova todas as pétalas e anteras da flor. Certifique-se de que o pistilo não esteja danificado e que o estigma esteja livre de pólen contaminante.
NOTA: Linhagens de plantas estéreis masculinas não requerem emasculação. - Devolva as plantas à câmara de crescimento e certifique-se de que as flores emasculadas não entrem em contato com outras plantas ou objetos estranhos.
2. Ensaio de hidratação polínica-aquisição de dados brutos
- Na manhã seguinte, retire as plantas da câmara de crescimento. Coloque a planta receptora de pólen de lado e posicione a flor no palco de um microscópio invertido (Figura 2) para que o estigma possa ser claramente visualizado.
- Fixe a posição da flor a ser fotografada imobilizando o caule em uma lâmina de vidro usando tiras de fita adesiva. Manter a temperatura entre 18 °C e 25 °C e umidade relativa do ar abaixo de 60%.
OBS: Para a linha de planta macho estéril pA9-barnase, o ideal é realizar o ensaio pela manhã, quando as flores se abrem e as pétalas não atrapalham o campo de visão. - Em seguida, remova uma flor saudável e recém-aberta da planta doadora de pólen. Coloque sob um microscópio dissecante e reúna alguns grãos de pólen na ponta da pinça limpa de ponta fina, tocando suavemente as anteras (Figura 3A). Um cílio colado a uma haste curta também é uma ferramenta eficaz para coletar e transferir pólen (Figura 3C).
- Retire o excesso de pólen das pinças, tocando-as levemente contra as pétalas das flores de onde os grãos de pólen foram colhidos, até que uma monocamada de grãos de pólen seja formada na ponta da pinça.
NOTA: Uma monocamada de grãos de pólen na ponta da pinça de ponta fina facilitará significativamente a transferência de grãos únicos nas etapas subsequentes. Também é possível obter um único grão de pólen na pinça por esta técnica (Vídeo Suplementar S1). - Retornar à planta receptora de pólen e, usando uma lente objetiva de baixa potência (por exemplo, lente objetiva 10x; Figura 3B), focalizar o microscópio invertido no estigma a ser polinizado.
- Segurando a pinça ao longo da abertura entre os braços da pinça (Figura 4), aproxime-se cuidadosamente de uma célula da papila estigmatizada não polinizada ('virgem').
NOTA: Descobrimos que este método de segurar a pinça auxilia a destreza e reduz o impacto do aperto de mãos. Um micromanipulador pode ser usado para usuários menos experientes ou com dificuldade em aplicar com precisão um único grão de pólen manualmente. - Selecione um grão de pólen adequadamente posicionado na pinça para transferência para o estigma. Continue a se aproximar da célula da papila estigmatizada não polinizada até que o grão de pólen selecionado faça contato leve com sua superfície. Retire lentamente a pinça e confirme a fixação do pólen (Figura 5).
NOTA: O Vídeo Suplementar S1 e o Vídeo Suplementar S2 demonstram esta etapa com grãos de pólen simples e múltiplos presentes na pinça. - Certifique-se de que o grão de pólen esteja orientado de tal forma que seu eixo equatorial seja claramente visível e em foco nítido. Mude imediatamente para uma lente objetiva de maior potência (por exemplo, 20x) e capture uma imagem do grão de pólen. Esta primeira imagem é T = 0. Continue a capturar mais imagens em intervalos de 1 min para um total de 10 min.
- Ajuste o foco conforme necessário para acomodar pequenos movimentos no grão de pólen ou estigma. Registrar a temperatura ambiente e a umidade relativa da sala a cada 2 min para permitir futuras comparações entre réplicas experimentais.
- Depois que todas as imagens tiverem sido capturadas, salve-as em um formato sem perdas, como o formato proprietário do fabricante ou como TIFFs.
OBS: Serão 11 imagens por grão de pólen amostrado (Figura Suplementar S1). As configurações de aquisição automatizada/manual de timelapse na maioria dos softwares proprietários de aquisição de imagens são recursos úteis para facilitar a organização de cada série temporal. - Repita as etapas 2.4 a 2.9 para grãos de pólen adicionais. Adquirir dados para números quase equivalentes de controle (tipo selvagem [WT]) e polinizações experimentais.
Figura 2: Configuração do equipamento utilizado para o bioensaio de hidratação polínica. Neste exemplo, uma linhagem de planta estéril macho pA9-barnase foi o receptor de pólen. A planta, dentro de seu vaso, foi colocada de lado, e o caule colado a uma lâmina de vidro posicionada no palco do microscópio. Para reduzir o estresse mecânico e auxiliar o posicionamento da planta, uma plataforma ajustável foi utilizada para apoiar o vaso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coleta dos grãos de pólen da flor doadora de pólen. As imagens mostram o uso de (A) pinça de ponta fina e (C) um pedaço de cílio. Aglomerados de pólen (seta vermelha) devem ser removidos encostando-os levemente nas pétalas das flores doadoras até que se obtenha uma monocamada de grãos de pólen (seta verde). (B) Imagem de alta resolução de um estigma de linhagem estéril de A. thaliana (Col-0) pA9-barnase macho não polinizado que atingiu o estágio de desenvolvimento adequado para o bioensaio de hidratação polínica. Barra de escala = 100 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Método de fixação da pinça na transferência do pólen para o estigma receptor. (A) Orientação incorreta para segurar a pinça; (B) orientação correta para segurar a pinça. Segurar a pinça lateralmente nessa configuração, significada pela posição do polegar entre os braços da pinça, proporciona maior estabilidade para facilitar a transferência dos grãos de pólen para papilas estigmaticas não polinizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Transferência de um único grão de pólen da ponta de um par de pinças para uma célula da papila estigmatizada não polinizada ('virgem') de uma planta estéril macho pA9-barnase. (A) Abordagem cuidadosa da célula da papila. (B) Fixação de um grão de pólen adequadamente posicionado (seta azul) à célula da papila (seta laranja). (C) Retirada da pinça e confirmação visual da fixação do pólen (seta roxa). Os painéis A-C foram fotografados com uma lente objetiva de 10x (distância de trabalho de 10,5 mm; abertura numérica de 0,25) e são instantâneos derivados do videoclipe apresentado no Vídeo Suplementar S1. (D) Transição para uma lente objetiva de 20x (distância de trabalho de 2,1 mm; abertura numérica de 0,5) para início da captura de imagens em uma série temporal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Dosagem de hidratação polínica
- Defina a taxa de hidratação polínica como a mudança no comprimento do semieixo menor (Figura 6) do grão de pólen (isto é, o raio equatorial) ao longo do tempo e apresente-a como variação percentual (equação [1]):
(1º) - Por meio de um software de análise de imagens, registramos os valores dos semieixos menores para cada grão de pólen da série experimental.
NOTA: O nome desta opção de medição depende do software, como 'Elipse rotacionada' ou 'Elipse de 5 pontos'. - Repita as etapas 3.1-3.2 para todos os outros grãos de pólen a serem medidos. Para consistência, aplique o mesmo grau de zoom digital e a mesma abordagem para definir o "limite de pólen" para todas as medições nos conjuntos de dados.
- Depois que todas as medições forem concluídas para uma série temporal, exporte os valores brutos do semieixo menor de cada pilha de imagens para uma planilha e apresente os dados em colunas por pilha de imagens. Garantir a inclusão de dados de pelo menos 15 grãos de pólen hidratados na análise de cada linhagem de planta (Tabela Suplementar S1).
- Não é incomum que um pequeno número de grãos de pólen não consiga se hidratar ou hidratar significativamente mais lentamente do que o esperado. Esses grãos "dud" podem ser o resultado do mau contato entre o grão e a célula da papila ou relacionados à viabilidade do pólen. Procure e exclua-os do conjunto de dados, a menos que sejam necessários em seu desenho experimental.
- Calcule os valores médios para cada ponto de tempo por linha de planta. Use testes t não pareados e ANOVA one-way para a análise estatística dos dados de hidratação de WT e linhas mutantes em cada ponto de tempo. Use um teste t múltiplo para a comparação simultânea das médias entre WT e linhas mutantes em vários pontos de tempo.
NOTA: As parcelas XY também são muito úteis para visualizar a tendência geral de hidratação do pólen entre as linhas de plantas que estão sendo comparadas.
(1º)
Figura 6: Hidratação do grão de pólen WT em uma célula da papila estigmática de A. thaliana (Col-0; pA9-barnase linha estéril masculina). (A) Ponto de tempo zero, 0 (0 MAPA) e (B) 10 MAPA. O círculo vermelho ao redor do grão de pólen é o "limite de pólen" definido e desenhado pelo operador usando um software de análise de imagem. As linhas verde e vermelha escura no interior do pólen representam os eixos semi-maior e semi-menor, respectivamente. O comprimento do semieixo menor é usado para calcular o grau de hidratação do pólen. Uma série temporal completa desse conjunto de dados pode ser encontrada na Figura Suplementar S1. A imagem foi obtida com objetiva de 20x (distância de trabalho de 2,1 mm; abertura numérica de 0,5). Barras de escala = 50 μm. Abreviação: MAP = min-after-pollination. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Representative Results
Esta seção apresenta dois conjuntos de exemplos de dados de hidratação polínica, coletados como descrito acima, para A. thaliana. O primeiro conjunto de dados consiste em três repetições de uma série temporal de hidratação polínica para plantas WT, com cada réplica coletada em um dia diferente. Cada réplica contém nada menos que 18 valores individuais de grãos de pólen, totalizando 55 grãos de pólen nas três repetições. Os valores mínimo e máximo das médias entre as repetições, para todos os momentos, ficaram dentro de 3% (Figura 7 e Tabela Suplementar S1). Esses dados representativos para as polinizações WT demonstram claramente o alto grau de consistência que pode ser obtido utilizando a metodologia aqui detalhada para números de amostra relativamente baixos e em diferentes dias.
Figura 7: Gráfico XY mostrando a consistência dos perfis de hidratação polínica selvagem de A. thaliana durante um período de tempo de 10 min. O progenitor polínico foi a adesão Col-0 de A. thaliana e o progenitor do pistilo foi a linhagem pA9-barnase macho estéril de A. thaliana (Col-0). Os dados representam três conjuntos de dados independentes coletados em dias diferentes e demonstram um alto grau de consistência. Um diagrama de caixa e whisker e a análise estatística das médias desses conjuntos de dados são apresentados na Figura Suplementar S2. O número de pólen medido ('n') para cada conjunto de dados independente é exibido ao lado da sintaxe (WT1/WT2/WT3) na figura. Abreviação: WT = wild type. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O segundo conjunto de dados foi obtido para uma linhagem vegetal que abriga uma inserção de DNA-T em um gene codificador de proteína de revestimento polínico gerando uma mutação "knockdown", aqui referida como "mutante KD". O pólen mutante foi depositado sobre estigmas estéreis machos pA9-barnase para o perfil de hidratação, conforme descrito no protocolo. Como pode ser visto pelos dados resultantes (Figura 8), pólen mutante e WT apresentaram perfis de hidratação indistinguíveis nos primeiros 5 min. No entanto, 5-10 min após a polinização (PAM), a mudança média do semieixo menor para o pólen mutante começou a ficar atrás do pólen WT, com a diferença tornando-se estatisticamente significativa em 10 MAP. Este resultado não só demonstra que esta proteína do revestimento polínico tem um papel na mediação da hidratação polínica, mas também ilustra bem a utilidade deste bioensaio de grão único de alta resolução para rastrear a hidratação do pólen. Neste exemplo em particular, sua sensibilidade foi capaz de detectar o efeito sutil de um "knockdown" de um gene codificador de proteína de revestimento de pólen.
Figura 8: Perfis de hidratação do pólen para WT e uma linhagem mutante de proteína "knockdown" do revestimento do pólen (mutante KD). (A) Perfis de hidratação durante um período de tempo de 10 min para WT e pólen mutante. Os genitores polínicos foram a adesão Col-0 de A. thaliana e o mutante proteína capsidial KD (também no fundo Col-0). Em ambos os casos, o pistilo genitor foi a linhagem pA9-barnase macho estéril de A. thaliana (Col-0). (B) Gráficos de caixa e whisker mostrando a extensão da hidratação do pólen (em termos de variação percentual do semieixo menor) em 5 MAP e 10 MAP para conjuntos de dados de WT e pólen mutante. Os bigodes representam os valores mínimo e máximo da amostra. As caixas representam o quartil inferior, a mediana e o quartil superior do conjunto de dados. As cruzes brancas representam a média do conjunto de dados. A análise do teste t não pareado mostra que a porcentagem média de hidratação polínica é significativamente diferente entre as duas linhagens de plantas a 10 MAP. Um asterisco indica p < 0,05 (teste t não pareado). Abreviações: WT = wild type; KD = knockdown; PAM = min-após-polinização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Série temporal do bioensaio de hidratação de pólen de um grão de pólen WT hidratando-se em uma célula da papila estigmatizada de uma planta estéril macho pA9-barnase ao longo de 10 min. As imagens foram realizadas em intervalos de 1 min. As imagens em 0 PAM e 10 PAM foram utilizadas na Figura 6 (anexadas separadamente). Barra de escala = 50 μm. Abreviações: WT = wild type; PAM = min-após-polinização. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Gráfico de caixa e whisker mostrando a extensão da hidratação do pólen (em termos de variação percentual do semieixo menor) durante um período de tempo de 10 min para os três conjuntos de dados de pólen WT descritos na Figura 7. O pistilo genitor foi a linhagem pA9-barnase macho estéril de A. thaliana (Col-0). Os bigodes representam os valores mínimo e máximo da amostra. As caixas representam o quartil inferior (dobradiça inferior), mediana (dobradiça média) e quartil superior (dobradiça superior) do conjunto de dados. Pontos de dados individuais são mostrados. A ANOVA one-way mostra que a porcentagem média de hidratação polínica entre os três conjuntos de dados não foi estatisticamente diferente entre si ao longo do período de tempo de 10 min. O limiar significativo é de p < 0,05 (ANOVA one-way). Abreviação: WT = wild type. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Dados de hidratação do pólen bruto utilizados para construir a Figura 7 (pólen de A. thaliana WT Col-0 sobre estigma estéril masculino pA9-barnase). Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S1: Um vídeo demonstrando a transferência de um único grão de pólen WT (acesso Col-0) na ponta de um par de pinças para uma célula de papila estigmatizada "virgem" (linha estéril masculina pA9-barnase). Para facilitar a acessibilidade do vídeo, a qualidade da imagem foi intencionalmente reduzida. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S2: Um vídeo demonstrando a transferência de um único pólen WT (acesso Col-0) de uma monocamada de grãos de pólen na ponta de um par de pinças para uma célula da papila estigmatizada "virgem" (linha estéril masculina pA9-barnase). Para facilitar a acessibilidade do vídeo, a qualidade da imagem foi intencionalmente reduzida. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Para as plantas com flores, os estágios iniciais da reprodução sexuada são sem dúvida os mais importantes. Ao nível da interação pólen-estigma, são tomadas decisões moleculares que determinam a "compatibilidade" dos parceiros que interagem. Tais decisões, se tomadas corretamente, evitam o desperdício de recursos que poderiam afetar a aptidão reprodutiva21. Assim, permitir que apenas pólen compatível efetue a fertilização é um componente importante para a manutenção de genótipos bem adaptados e, consequentemente, para o sucesso evolutivo das espécies. As pesquisas realizadas com a planta-modelo A. thaliana têm sido extremamente valiosas para aprofundar o entendimento desse processo. Diversos estudos realizados nas últimas décadas têm revelado a presença de fatores no tegumento polínico que atuam no primeiro "checkpoint" de compatibilidade, onde o pólen ganha acesso à água estigmatizada para permitir a hidratação polínica13. Apesar desses primeiros insights sobre os mecanismos que regulam a compatibilidade pólen-estigma, ainda existem muitas lacunas em nossa compreensão desse processo. Até o momento, nenhum mutante de ligantes transmitidos por pólen ou receptores estigmatáticos conhecidos por afetar a hidratação polínica pode bloquear completamente a polinização compatível, sugerindo a presença de outros determinantes de hidratação polínica não descobertos. Por ser capaz de observar prontamente o fenótipo de interesse, o bioensaio de hidratação polínica aqui descrito é uma das técnicas mais simples para estudar potenciais mutantes que regulam a polinização.
As metodologias existentes para medir a hidratação do pólen comumente utilizam polinizações em massa e relatam menos pontos de tempo 14,22,23, podendo, portanto, perder fenótipos importantes do perfilde hidratação sutil. Por exemplo, o estudo de Wang et al.13, juntamente com trabalhos sobre outros mutantes da proteína do revestimento polínico em nosso laboratório (observações não publicadas), revelaram diferenças intrigantes nos perfis de hidratação entre mutantes. Tais diferenças sutis podem conter pistas importantes para os mecanismos regulatórios subjacentes à polinização compatível.
O método aqui descrito concentra-se na aquisição de números relativamente pequenos de medição entre linhagens mutantes e WT, com ênfase na precisão metodológica para reduzir a variação dentro dos conjuntos de dados. Embora este método seja altamente reprodutível (como mostrado na Figura 7), supondo que a temperatura e a umidade sejam adequadamente controladas, é importante coletar dados de hidratação para números quase iguais de WT e pólen mutante no mesmo dia para reduzir ainda mais o potencial de variação. Os dados podem ser agrupados em dias diferentes, se necessário. Além disso, a seleção das plantas de controle de WT apropriadas é vital para a correta interpretação dos resultados da hidratação. Para o receptor de pólen, a mesma linhagem de planta deve ser usada para receber tanto grãos de pólen de controle WT quanto de pólen mutante.
Por exemplo, usamos a linhagem de planta estéril macho pA9-barnase, que também é apresentada no protocolo de vídeo, como receptor de pólen para pólen WT (controle) e mutante (experimental) ao investigar linhagens mutantes de pólen de DNA-T (como o mutante 'KD' descrito na Figura 8). A mistura de dados de uma linha estéril masculina, que não precisa ser emasculada, com aqueles coletados de uma linha de controle emasculada manualmente deve ser evitada, pois esses estigmas provavelmente se comportarão de forma diferente. Da mesma forma, linhagens mutantes emasculadas devem ser utilizadas em conjunto com uma linha WT (controle) emasculada sempre que possível. O mesmo cuidado também deve ser aplicado ao considerar o background genético das plantas em estudo. Enquanto as coleções mais populares de mutantes de DNA-T foram geradas no fundo Col-0, outras, como a coleção FLAG do Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), estão disponíveis no background genético de Wassilewskija (WS)24,25. Nesses casos, é aconselhável usar as linhas de planta WT do respectivo ecótipo como controle.
Embora aqui tenhamos focado na hidratação do pólen durante os primeiros 10 min da interação pólen-estigma, este método também pode ser adaptado para abranger perfis de hidratação que cobrem um período de tempo mais longo. Uma característica fundamental do protocolo é que as flores permanecem aderidas à corrente da planta-mãe, os protocolos publicados normalmente requerem a excisão do pistilo e a colocação em meios para sustentar o tecido durante o experimento14,18,26. Embora não haja evidências diretas que sugiram que tal abordagem semi in vivo impacte a hidratação polínica ou altere a regulação in vivo desse processo, é concebível que a excisão das flores da planta mãe possa afetar a polinização. Assim, este protocolo consegue um verdadeiro ambiente in vivo para o estudo da interação pólen-estigma, onde a integridade estrutural da planta é preservada.
A transferência de grãos de pólen simples para papilas estigmatizadas "virgens" é, sem dúvida, uma das operações mais desafiadoras descritas neste protocolo. Não é incomum transferir aglomerados de grãos de pólen por engano. No entanto, a chance de isso ocorrer pode ser bastante reduzida, garantindo que apenas uma monocamada de pólen esteja presente na pinça (Figura 3A) (ou mesmo apenas um único grão de pólen; Figura 5) e/ou utilizando grãos de pólen já orientados, de modo que se "projetem" de outros na ponta da pinça. Descobrimos que um operador experiente pode completar com sucesso a transferência de um único pólen para uma célula de papila estigmatizada em aproximadamente 3 min e registrar dados de até cinco grãos de pólen durante um período de 1 h. Assim, durante um período de 2-4 dias, dados suficientes podem ser acumulados para uma análise estatística significativa das linhagens de plantas em estudo.
O erro humano é potencialmente a maior fonte de variação na análise de conjuntos de dados derivados de estudos que utilizam esse protocolo. Por exemplo, a definição do "limite do pólen" durante a análise de imagens se resume ao julgamento do pesquisador individual. Assim, existe o potencial de que medidas feitas por diferentes pesquisadores, mesmo no mesmo conjunto de dados, possam gerar variação. Sempre que possível, um único pesquisador deve realizar as medições para minimizar os erros de amostragem. Além disso, o acoplamento da análise de WT e conjuntos de dados mutantes pelo mesmo operador nega a definição potencialmente subjetiva de "limite de pólen" e variação interoperador.
Em conclusão, um método sofisticado e preciso para medir o perfil de hidratação polínica no organismo modelo A. thaliana é descrito. Nós demonstramos que, utilizando este protocolo, dados altamente consistentes de hidratação polínica para A. thaliana podem ser facilmente adquiridos. Três lotes independentes de dados para polinizações WT adquiridas em dias diferentes mostraram pequenos desvios consistentes de <3% em todos os momentos (Figura 7 e Tabela Suplementar S1). Embora o bioensaio aqui apresentado seja um pouco mais complexo do que a maioria dos protocolos existentes, a resolução dos dados gerados é superior e adequada para a identificação e caracterização de novos mutantes que impactam vias reguladoras de polinização compatível.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de pós-graduação da University of Bath (University of Bath, Bath, UK, BA2 7AY) para Y.-L.L. e L.W. A Figura 1 foi criada com BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
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