Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.
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Articolo metodologico
Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all'interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall'applicazione di questo protocollo prima del prelievo d'organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.
Introduzione
La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per a....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le regole e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Sebbene il metodo primario di eutanasia descritto sia considerato una tecnica accettabile per l'eutanasia dall'American Veterinary Medical Association12, non è stato trovato per portare alla cessazione di un battito cardiaco13. Anche il metodo secondario frequentemente usato di doppia pithing non impedisce questo, né rimuove il cuore dall'animale. Il dissanguamento di animali anestetizzati è considerato un ....
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Risultati
Dopo una perfusione riuscita, tutti i tessuti (escluso il fegato in Xenopus pigmentato) saranno nettamente più leggeri e meno saturi di sangue. I principali vasi sanguigni diventeranno meno evidenti (Figura 10) e i tessuti (escluso il fegato) risciacqueranno in modo pulito nel tampone dopo essere stati campionati. Mentre la corretta esecuzione del protocollo può essere confermata solo dalla qualità dei dati provenienti da campioni di tessuto dissanguato, diversi problemi tipici, le .......
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Discussione
Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.
Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l'efficacia di questa procedura, i risultati posso.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal OD031956 di sovvenzione OD R24 del NIH e dal HD073104 della sovvenzione NICHD R01. Ringraziamo Darcy Kelly per le utili discussioni e gli input iniziali su questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan per la loro assistenza e supporto, nonché i nostri tre revisori anonimi per il loro feedback.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
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| Pipette di trasferimento monouso | VWR | 414004-036 | |
| Pinza da dissezione a punta fine | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Forbici da dissezione affilate piont, dritte 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| I | Fisher Scinetific | 14-370-284 | sono un'alternativa accettabile |
| Contenitore per eutanasia | Articolo in plastica negli Stati Uniti | . 2860 | contenitori opachi alternativi accettabili |
| Coperchio del contenitore per eutanasia | Plastica USA | Articolo 3047 | |
| Perni di dissezione fine Living | Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| Aghi ipodermici per uso generale, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | per X. laevis |
| Aghi ipodermici per uso generale, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | per X. tropicalis |
| Eparina, mucosa | intestinale suinaLe forbici per iride MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| " | vwr | 470018-938 | sono un'alternativa accettabile |
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| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
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| Bicarbonato di sodio, polvere, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
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Riferimenti
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B.
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Ristampe e permessi
