هنا ، يتم وصف نهج بسيط وسريع لأداء الحقن داخل بطانة الرحم البطينية في الفئران باستخدام نهج اليد الحرة (أي بدون جهاز مجسم).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
غالبا ما يتطلب فحص أنظمة الغدد الصم العصبية توصيل الأدوية أو الفيروسات أو العوامل التجريبية الأخرى مباشرة إلى أدمغة الفئران. يسمح الحقن داخل بطانة الرحم البطينية (ICV) بتوصيل العامل التجريبي على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ (خاصة في الهياكل القريبة من البطينين). هنا ، يتم وصف طرق إجراء حقن ICV اليد في الفئران البالغة. باستخدام المعالم البصرية واللمسية على رؤوس الفئران ، يمكن إجراء الحقن في البطينين الجانبيين بسرعة وموثوقية. يتم إجراء الحقن باستخدام حقنة زجاجية مثبتة في يد المجرب وتوضع على مسافات تقريبية من المعالم. وبالتالي ، فإن هذه التقنية لا تتطلب إطارا مجسما. علاوة على ذلك ، لا تتطلب هذه التقنية سوى تخدير إيزوفلوران قصير ، مما يسمح بالتقييم اللاحق لسلوك الفئران و / أو علم وظائف الأعضاء في الفئران المستيقظة التي تتصرف بحرية. يعد حقن القيمة المحلية الحر أداة قوية للتوصيل الفعال للعوامل التجريبية إلى أدمغة الفئران الحية ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى مثل أخذ عينات الدم بشكل متكرر أو التلاعب بالدوائر العصبية أو التسجيل في الجسم الحي للتحقيق في عمليات الغدد الصم العصبية.
المقدمة
غالبا ما يكون توصيل العوامل التجريبية ، مثل الأدوية1 أو الفيروسات2 أو الخلايا3 ، إلى الدماغ ضروريا لأبحاث الغدد الصم العصبية. إذا كان العامل لا يعبر بسهولة الحاجز الدموي الدماغي أو كان الهدف التجريبي هو اختبار التأثيرات المركزية للعامل على وجه التحديد ، فمن المهم أن يكون لديك طريقة موثوقة لتوصيل الحقن إلى الدماغ. علاوة على ذلك ، يوفر الحقن في الفضاء داخل المخ البطيني (ICV) الفرصة لتوزيع العامل على نطاق واسع في الدماغ ويوفر منطقة مستهدفة كبيرة ، مما يزيد من احتمال نجاح الحقن2.
تتضمن الطريقة الشائعة لصنع حقن القيمة المحلية وضع قنية دائمة في الداخل. في هذا النهج ، يعد الإطار التجسيمي ضروريا لوضع القنية المتاحة تجاريا أو المصنوعة حسب الطلب ، حيث يتم لصق القنية أو تثبيتها في مكانها. في كثير من الأحيان ، عند الشفاء ، يتم إعطاء جرعة فوق فسيولوجية من الأنجيوتنسين II من خلال القنية ، وإذا لوحظ سلوك الشرب على الفور ، اعتبار القنية موضوعة بشكل صحيح4. هذا النهج له العديد من المزايا ، بما في ذلك القدرة على إجراء التسريب على المدى الطويل والقدرة على حقن نفس عدة مرات. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم استخدام الأنجيوتنسين II ، يمكن تأكيد الموضع الصحيح قبل إعطاء المركبات التجريبية. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على وضع قنية دائمة ، بما في ذلك الحاجة إلى معدات باهظة الثمن (إطار مجسم) ، وإمكانية تلف القنية بعد وضعها (على سبيل المثال ، يمكن للفئران مضغ قنية رفيقة القفص) ، وإمكانية حدوث عدوى حول القنية الدائمة. يمكن إجراء حقن ICV واحدة باستخدام إطار تجسيمي3 ، والذي ، على الرغم من فعاليته ، يتطلب تعرضا كبيرا للتخدير ، وبالتالي قد يحجب بعض الآثار الفسيولوجية والسلوكية الحادة للعلاج. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب وضع الفئران في إطار تجسيمي تدريبا كبيرا لتحقيق وضع مستقر ومنع تمزق قنوات الأذن.
هنا ، يتم وصف طريقة ثابتة لإجراء حقن اليد الحرة في الفئران. تعتمد هذه الطريقة على التقارير السابقة 5,6. تتمثل مزايا هذه التقنية في أنها بسيطة وسريعة ولا تتطلب معدات متخصصة مثل الإطار المجسم. كما هو موضح أدناه ، يتضمن هذا الإجراء معالجة حقنة زجاجية بالنسبة للمعالم الموجودة على رأس الماوس لإجراء الحقن ، والتي يمكن إجراؤها بسرعة ، وبالتالي لا تتطلب سوى بضع دقائق من التخدير بالغاز في اليوم التجريبي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل جامعة ولاية كولورادو (# 3960) ولجان رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في سان دييغو ، حيث تم جمع البيانات التمثيلية (S13235 ، PI Kellie Breen Church). تم تصوير البيانات من خمس إناث بالغات واثنين من ذكور الفئران C57 / BL6 (9-16 أسبوعا) في قسم البيانات التمثيلية. تم استئصال المبيض لإناث الفئران قبل 3-4 أسابيع من حقن القيمة المحلية وجمع الدم كما هو موضح سابقا7. قبل التجريب ، تم إيواء هذه الفئران بدورة ضوء مظلم لمدة 12 ساعة / 12 ساعة وكان لها حرية الوصول إلى الأعلاف والمياه وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر.
1. إجراء حج القحف
ملاحظة: يمكن إجراء حج القحف قبل يوم واحد أو أكثر من الحقن الفعلي ، مما يجعل عملية الحقن أسرع في يوم التجربة.
- تحضير المواد لحج القحف كما هو موضح أدناه.
- ضع وسادة مقعد نظيفة أو مادة ثنى على سطح العمل. قم بلصق مخروط أنف مبخر isoflurane على سطح العمل (بالقرب من المجرب ، ولكن مواجها بعيدا عنه ؛ انظر الشكل 1 أ).
- ضع أنبوب سيلاستيك على نهاية إبرة حادة معقمة 18 جم بحيث يبرز ~ 1 مم من طرف الإبرة. ضع أنبوب سيلاستيك في نهاية إبرة حادة معقمة بحيث يبرز ~ 1 مم من طرف الإبرة.
ملاحظة: يجب استخدام إبر منفصلة ومعقمة معبأة مسبقا (حادة وغير حادة) لكل ماوس. - اجمع ماكينة حلاقة كهربائية ومقشر باليود وشاش معقم ومنصات كحولية لإعداد موقع الحقن.
- تدرب على تحريك إبرة 2 مم جانبية و 1 مم ذيلية كما هو موضح أدناه.
- استخدم مسطرة وقلما لتمييز ورقة بنقطة بداية (ستكون هذه بريجما) ، وعلامة 2 مم إلى اليسار أو اليمين ، وعلامة أخرى 1 مم فوق آخر علامة (سيكون هذا هو موقع الحقن ؛ انظر الشكل 1 ب).
- تدرب على تحريك الإبرة من نقطة البداية إلى النقطة 1 إلى النقطة 2 (bregma إلى موقع الحقن) حتى تتأكد من أن الحركة قابلة للتكرار بدون أدلة.
ملاحظة: الإحداثيات الموصوفة هنا فعالة في الفئران البالغة C57 / BL6 ، ولكن قد تتطلب السلالات أو الفئات العمرية الأخرى تعديلا.
- تحضير الماوس لحج القحف كما هو موضح أدناه.
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الماوس بنسبة 3٪ -4٪ إيزوفلوران في الأكسجين الطبي. مع الممارسة والإلمام بالإجراء ، قلل المدة الإجمالية للتعرض للأيزوفلوران إلى أقل من 10 دقائق لإجراء حج القحف.
تنبيه: التعرض للإيزوفلوران يشكل خطرا على صحة الإنسان. استخدام مبخر إيزوفلوران معتمد وخاضع للتفتيش في منطقة جيدة التهوية مع وسائل كسح غازات النفايات. - بمجرد غياب منعكس إصبع القدم ، حلق رأس. تطبيق مواد تشحيم العين.
- ضع الماوس على سطح العمل مع وضع الرأس في مخروط الأنف للحفاظ على التخدير.
- تطبيق عامل مسكن، مثل البوبرينورفين (0.6-0.8 ملغم/كغم من وزن جسم الفأر، تحت الجلد)، حسب توجيهات المورد.
- قم بتنظيف موقع الحقن عن طريق مسح الرأس بشاش معقم مغموس في محلول اليود (قم بإجراء ثلاثة دعك) ، ثم امسحه باستخدام وسادة فرك الكحول (أداء ثلاث مرات).
ملاحظة: قم بإزالة الفراء وتنظيف الجلد حول موقع الحقن واستخدم أدوات وإبر معقمة ، على النحو الموصى به من قبل الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية لمنع العدوى.
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الماوس بنسبة 3٪ -4٪ إيزوفلوران في الأكسجين الطبي. مع الممارسة والإلمام بالإجراء ، قلل المدة الإجمالية للتعرض للأيزوفلوران إلى أقل من 10 دقائق لإجراء حج القحف.
- امسك رأس الماوس بحزم باليد غير المهيمنة. ضع الرأس مسطحا على سطح العمل قدر الإمكان.
- حدد موقع الحقن.
- استخدم إبرة 18 G الحادة المعدة لتحديد bregma أولا ؛ لهذا ، اسحب الإبرة عبر جلد الرأس على طول خط الوسط ، وتحرك في المستوى الذيلي المنقاري. تخيل مثلثا متساوي الأضلاع يكون فيه الرأسان هما العينان والرأس الثالث هو الموقع التقريبي للبريغما (انظر الشكل 1C).
- من bregma ، حرك الإبرة 2 مم الجانبية و 1 مم الذيلية إلى موقع الحقن.
- أثناء إمساك الإبرة عموديا ، ادفع الإبرة بقوة عبر الجلد والعظام حتى يتدفق الأنبوب مع الجلد.
- اسحب الإبرة وقم بتدوير الإبرة واضغط على الجلد والعظام مرة أخرى. كرر العملية حتى يتم إنشاء ثقب صغير في العظام.
- استخدم الإبرة الحادة للتحقق من وجود ثقب كاف في العظام. اهدف إلى جعل فتحة في العظم كبيرة بما يكفي لمرور الإبرة غير الحادة.
- أخرج الماوس من مخروط الأنف ، ونظف أي دم من موقع الحقن بشاش معقم ، وضع الماوس في قفص على جهاز تدفئة قفص حتى يستيقظ. نظرا لأن الفتحة التي أحدثها حج القحف صغيرة (إبرة 18 جم) ، لا يلزم إغلاق الموقع بخياطة أو مقاطع جرح.
ملاحظة: الفتحة المنتجة هنا صغيرة (18 جم) ، لذلك تعتبر العديد من المؤسسات هذا الإجراء حقنة بدلا من الجراحة. علاوة على ذلك ، على الرغم من إجراء فتحة عبر الجلد والعظام إلى الدماغ ، فإن تثبيت الجلد مشدودا يؤدي إلى عدم محاذاة الثقوب ، مما يساعد على الأرجح في منع نباتات الجلد أو فراش القفص من الاتصال بالدماغ.
2. جعل الحقن
- تحضير المواد للحقن كما هو موضح أدناه.
- ضع وسادة مقعد نظيفة أو مادة ثنى على سطح العمل. قم بلصق مخروط أنف مبخر isoflurane على سطح العمل (بالقرب من المجرب ، ولكن مواجها بعيدا عنه ؛ انظر الشكل 1 أ).
- قم بتوصيل إبرة بطول 10 مم 27 جم مع شطبة 45 درجة على حقنة زجاجية سعة 5 ميكرولتر. ضع أنبوب سيلاستيك على الإبرة بحيث يبرز 3.5 مم من طرف الإبرة ؛ استخدم الشريط اللاصق المختبري لتثبيت الأنبوب على جسم المحقنة (انظر الشكل 1 د).
- تحضير وسائط الحقن (دواء أو فيروس أو سائل آخر للحقن) في أنبوب. بالنسبة للنتائج التمثيلية في هذه الدراسة ، تم حقن محلول ملحي متساوي التوتر معقم.
ملاحظة: حدد أنبوبا يسمح بالوصول عن طريق المحقنة الزجاجية والإبرة ، مثل أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل. - ارسم 3 ميكرولتر من وسائط الحقن في المحقنة الزجاجية. أولا ، ارسم أكثر من الحجم المطلوب ، وأخرجه حتى يبقى 3 ميكرولتر في المحقنة.
- جمع فرك اليود ، الشاش المعقم ، ومنصات الكحول لإعداد موقع الحقن.
- ابدأ تشغيل مؤقت المختبر في وضع العد التنازلي وضع المؤقت بحيث يكون مرئيا للمجرب أثناء إجراء الحقن.
- تدرب على تحريك إبرة جانبية 2 مم وذيلية 1 مم كما تم إجراؤها في اليوم السابق.
- تحضير الماوس للحقن كما هو موضح أدناه.
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران. بمجرد غياب منعكس إصبع القدم ، ضع مادة تشحيم العين ، وضع الماوس على سطح العمل مع وضع الرأس في مخروط الأنف.
- نظف موقع الحقن بثلاث مناديل لكل من اليود والكحول. حدد موقع الحقن بإبرة 18 جم (أو إبرة حادة) كما هو موضح في الخطوة 1.8. يجب أن يكون الثقب الذي تم إنشاؤه أثناء حج القحف قابلا للاكتشاف.
ملاحظة: إذا لم يتم إجراء حج القحف مسبقا ، أو إذا كان الثقب في الجمجمة غير قابل للاكتشاف ، فيمكن إجراء حج القحف هنا.
- قم بإجراء الحقن باستخدام حقنة زجاجية كما هو موضح أدناه.
- امسك رأس الماوس بحزم باليد غير المهيمنة. ضع الرأس مسطحا على سطح العمل قدر الإمكان.
- ضع إبرة المحقنة الزجاجية من خلال الفتحة الموجودة في الجمجمة حتى يستقر الأنبوب الموضوع فوق الإبرة المحضرة في الخطوة 2.1.2 على جلد الفأر.
- امسك المحقنة عموديا قدر الإمكان ، مع الانتباه إلى كل من الطائرات الإكليلية والسهمية. حقن الوسائط ببطء على مدى 1 دقيقة.
- ثبت المحقنة والإبرة في مكانها لمدة دقيقة أخرى بعد الانتهاء من الحقن لتقليل التدفق العكسي. اسحب الإبرة ببطء من رأس الماوس.
- أخرج الماوس من مخروط الأنف ، ونظف أي دم من موقع الحقن بشاش معقم (إذا كان هناك أي وجود) ، وضع الماوس في قفص على قفص أكثر دفئا حتى يستيقظ.
3. تأكيد موقع الحقن
- تخدير الفأر بعمق وتعطيره بالمحلول الملحي و 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كما هو موضح سابقا8. تخزين الدماغ في 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني في 4 °C حتى يغرق الدماغ (عادة 2 أيام).
- قطع 20-50 ميكرومتر المقاطع الإكليلية على cryostat كما هو موضح سابقا9. أثناء التقسيم ، لاحظ مجرى الحقن في كتلة الأنسجة. سجل ما إذا كان مجرى الحقن يتقاطع بوضوح مع البطين الجانبي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند تنفيذها بنجاح ، تسمح هذه التقنية بالتسليم السريع لعامل تجريبي في نظام البطين. يظهر في الشكل 2 أ ملف تعريف نبض الهرمون اللوتيني (LH) من فأر تم استئصال المبيض وتلقى حقنة ICV بقيمة 3 ميكرولتر من محلول ملحي متساوي التوتر معقم ، وهو وسيلة للعديد من المركبات الدوائية. يوضح هذا المثال أن التعرض القصير للتخدير الغازي وحقن 3 ميكرولتر من السائل في نظام البطين وحده لم يغير إفراز الهرمون اللوتيني النابض. في 3 ساعات بعد حقن ICV ، تم القتل الرحيم للحيوان ، وتم جمع الأنسجة العصبية الطازجة المجمدة وقطعه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، يتم وصف وسيلة بسيطة وفعالة لإجراء حقن ICV في الفئران. نظرا لأن هذه التقنية لا تتطلب إطارا مجسما ، فإن هذا النهج للتوصيل المركزي للأدوية والعوامل التجريبية متاح لمزيد من الباحثين. بالإضافة إلى ذلك ، يعد هذا النهج إنتاجية عالية نسبيا حيث يمكن إجراء التحضير والحقن بسرعة.
نظرا لأن هذا الإجراء يتطلب معالجة الإبر والمحقنة الزجاجية يدويا باستخدام مسافات تقريبية ، ينصح بأن يكرس الممارس الجديد بعض الوقت لممارسة الحركات قبل العمل مع الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون جثث الفئران مفيدة لممارسة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر الدكتورة كيلي برين تشيرش والسيد مايكل كريسمان والسيدة جيسيكا جانغ على مساهماتهم في جمع البيانات المبينة في النتائج التمثيلية. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إبر حادة عيار 18 | SAI Infusion | B18-150 | |
| إبر قياس 18 | BD ضمادات كحول 305195 | ||
| الطبية فيشر Scientific | 22-363-750 | ||
| وسادة مقعد | فيشر Scientific | 14-206-62AC22 | |
| محلول البيتادين | فيشر Scientific | NC1696484 | |
| بوبرينورفين | باترسون بيطري توريد | 07-892-5235 | مادة خاضعة للرقابة |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| حقنة زجاجية | هاميلتون | 7634-01 | |
| إبرة حقن | هاميلتون | 7803-01 | 27 مقياس ، إبرة RN ذات محور صغير ، نمط النقطة: 4 ، طول الإبرة: 10 سم ، الزاوية: 45 |
| Isoflurane ؛ | باترسون البيطري توريد | 07-893-8441 | |
| مبخر إيزوفلوران | Vet Equip | V-10 | |
| شريط مختبر | VWR | 89098-128 | |
| الأكسجين الطبي | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| فوسفات مخزن محلول ملحي | فيشر Scientific | J67802. برنامج K2 | |
| PulsaR | مفتوح المصدر ، جامعة أوتاجو | انظر المرجع 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| الأنابيب الصرازية (معرف 0.040 بوصة) | DOW | 508-005 | |
| الأنابيب السيلية (0.078 بوصة معرف) | DOW | 508-009 | |
| محلول ملحي معقم | VWR | 101320-574 | |
| السكروز | فيشر العلمي | S5-500 |
المراجع
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
