JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
English

Automatically Generated
Cancer Research

Screening av ionekanaler i kreftceller

Published: June 16, 2023
doi:
10.3791/65427
, , , , , ,
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology,University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy,University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Den farmakologiske målrettingen av ionkanaler er en lovende tilnærming til behandling av solide svulster. Detaljerte protokoller er gitt for å karakterisere ionkanalfunksjon i kreftceller og analysere effekten av ionkanalmodulatorer på kreftens levedyktighet.

Abstract

Ionkanaler er kritiske for celleutvikling og opprettholdelse av cellehomeostase. Forstyrrelsen av ionkanalfunksjonen bidrar til utviklingen av et bredt spekter av lidelser eller kanalopatier. Kreftceller bruker ionkanaler for å drive sin egen utvikling, samt å forbedre seg som en svulst og å assimilere i et mikromiljø som inkluderer forskjellige ikke-kreftceller. Videre kan økninger i nivåer av vekstfaktorer og hormoner i tumormikromiljøet resultere i forbedret ionkanaluttrykk, noe som bidrar til kreftcelleproliferasjon og overlevelse. Dermed er den farmakologiske målrettingen av ionkanaler potensielt en lovende tilnærming til behandling av solide maligniteter, inkludert primær og metastatisk hjernekreft. Her beskrives protokoller for å karakterisere funksjonen til ionkanaler i kreftceller og tilnærminger for å analysere modulatorer av ionkanaler for å bestemme deres innvirkning på kreftens levedyktighet. Disse inkluderer farging av en celle (er) for en ionkanal (er), testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier, etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi og utførelse av levedyktighetsanalyser for å vurdere stoffets styrke.

Introduction

Membrantransportproteiner er kritiske for kommunikasjon mellom celler, samt for å opprettholde cellulær homeostase. Blant membrantransportproteinene tjener ionkanaler til å drive vekst og utvikling av celler og for å opprettholde tilstanden til celler i utfordrende og skiftende miljøer. Ionekanaler har også blitt rapportert å drive og støtte utviklingen av solide svulster, både systemisk og i sentralnervesystemet (CNS)1,2. For eksempel er KCa3.1-kanaler ansvarlige for å regulere membranpotensialet og kontrollere cellevolumet, noe som er viktig i cellesyklusregulering. Defekte KCa3.1-kanaler har blitt rapportert å bidra til unormal spredning av tumorceller3. Videre kan ionekanaler bidra til metastatisk spredning av kreft. Transient receptor potential (TRP) kanaler, for eksempel, er involvert i Ca 2+ og Mg2+ tilstrømning; Denne tilstrømningen aktiverer flere kinaser og varmesjokkproteiner som fungerer for å regulere den ekstracellulære matrisen rundt en svulst, noe som igjen er viktig for å initiere kreftmetastase4.

Siden ionekanaler kan bidra til utvikling av kreft, kan de også være mål for legemiddelrelatert kreftbehandling. For eksempel er resistens mot behandlingsmodaliteter, inkludert kjemoterapi og ny immunterapi, relatert til dysregulering av ionkanalfunksjon 5,6,7. I tillegg fremstår ionkanaler som viktige legemiddelmål for å hindre vekst og utvikling av kreft, med repurposed small molecule (FDA-godkjente) legemidler som undersøkes, samt biopolymerer, inkludert monoklonale antistoffer 1,2,8,9. Mens det har vært mye fremgang på denne fronten, er ionkanal kreftmedisinoppdagelse fortsatt underutviklet. Dette skyldes delvis de unike utfordringene ved å studere ionekanaler i kreftceller. For eksempel er det tekniske begrensninger i å sette opp elektrofysiologianalyser for langsomvirkende forbindelser og tidsmessige forskjeller i kanalaktivering og medikamentvirkning. Videre kan løseligheten av forbindelser også hindre fremgang, da de fleste av de automatiserte elektrofysiologisystemene som vanligvis brukes i dag, bruker hydrofobe substrater, noe som kan bidra til artefakter som følge av sammensatt adsorpsjon. I tillegg er store bioorganiske molekylære terapier som naturlige produkter, peptider og monoklonale antistoffer teknisk utfordrende å screene ved hjelp av konvensjonelle elektrofysiologianalyser10. Endelig forblir de bioelektriske egenskapene til kreftceller dårlig forstått11.

I mellomtiden er immunfluorescensfarging av ionkanaler ofte utfordrende. Dette skyldes delvis kompleksiteten i deres strukturer og deres kontekst i membranen, noe som påvirker evnen til både å generere og anvende antistoffer for mikroskopistudier. Det er spesielt viktig at antistoffene som brukes til å flekke ionekanaler er validert for spesifisitet, affinitet og reproduserbarhet. Kommersielle antistoffer for ionekanaler bør vurderes basert på deres valideringsstrategi og publikasjonsrekord. Eksperimenter bør inkludere negative kontroller for å demonstrere mangelen på uspesifikk binding ved enten knockdown eller knockout av målproteinet. Alternativt kan cellelinjer der målproteinet er fraværende eller i lav overflod basert på mRNA- eller proteinbestemmelser, tjene som negative kontroller. For eksempel viser denne studien lokaliseringen av (GABA) reseptorunderenheten Gabra5 i en medulloblastomcellelinje (D283). D283-celler med siRNA-knockdown og Daoy-celler, en annen cerebellar medulloblastomcellelinje, ble farget for Gabra5 og viste ingen nevneverdig farging (data ikke vist).

Her presenteres metoder for å analysere og analysere ionkanalfunksjonen, samt effekten av ionkanalmodulatorer på kreftceller. Protokoller er gitt for (1) fargeceller for en ionkanal, (2) testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier, (3) etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi og (4) in vitro legemiddelvalidering. Disse protokollene legger vekt på studier av type A gamma-aminosmørsyre (GABAA) reseptor 2,12,13,14,15,16, en kloridanionkanal og viktig hemmende nevrotransmitterreseptor. Metodene som presenteres her gjelder imidlertid for å studere mange andre kreftceller og ionekanaler.

Protocol

1. Immunmerking ionkanaler i dyrkede celler Klargjøring av cellene og eksperimentelt oppsettOpprettholde cellene som en aktivt voksende kultur i 75 cm2 kulturflasker. Pass cellene en gang til de blir 50% -90% sammenflytende, avhengig av doblingstiden til cellelinjen som brukes.MERK: For denne studien ble D283-celler, en gruppe 3-medulloblastomcellelinje, brukt. Samle cellene fra kulturkolben inn i et sentrifugerør (15 ml eller 50 ml), og tilsett 2 ml 0,25% trypsin-EDTA for å…

Representative Results

Ovenfor er utvalgte prosedyrer som kan brukes til å karakterisere ionkanaler i kreftceller. Den første protokollen fremhever fargingen av en ionkanal. Som beskrevet er det mange utfordringer når du farger en ionkanal eller for den saks skyld noe protein som er tilstede i den ekstracellulære membranen. Vist i figur 1 er fargingen for en underenhet av den pentameriske GABA A-reseptoren. Den andre protokollen fremhever resultatene av å teste den polariserte tilstanden til mitoko…

Discussion

Endringer i ionkanalfunksjonen endrer intracellulære signalkaskader, noe som kan påvirke den generelle funksjonen til en celle. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at ionkanaler er viktige for kreftcellevekst og metastase. Det er viktig at mange ionkanaler er primære mål for godkjente terapier rettet mot et bredt spekter av lidelser24. Etterforskere har undersøkt om ionkanaler kan være anti-kreftmål, og de første resultatene er lovende 2,16,25</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkjenner støtte fra Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation til SS og Harold C. Schott Foundation finansiering av Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, til SS

Materials

ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS – Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
  25. Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
  26. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  27. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  28. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
  29. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  30. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  32. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  33. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  34. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  35. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

Tags

Ion ChannelsCancerTumor MicroenvironmentGABA A ReceptorChannelopathiesElectrophysiologyCell ViabilityCancer Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image