用于评估结核病疫苗效力的微菌落形成单位检测法

摘要

菌落形成单位（CFU）的测定是定量细菌（包括需要数周时间才能形成可见菌落的Mycobacterium tuberculosis）的金标准技术。本文介绍一种微型菌落形成单位（micro-CFU）测定方法，该方法提高了时间效率，减少了实验室空间和试剂成本，并可扩展应用于中高通量实验。

摘要

结核病（TB）是全球由传染病原体导致死亡的首要原因，2022年造成160万人死亡，仅在2019至2021年新冠疫情流行期间被COVID-19超越。该疾病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起。牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）减毒株卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一可用的结核病疫苗，也是全球使用时间最长的获批疫苗，至今仍在广泛应用。目前，有12种疫苗正处于临床试验阶段，另有数十种疫苗处于临床前研发中。在临床前研究中评估结核病疫苗有效性的首选方法是菌落形成单位（CFU）计数法。这一方法耗时较长，完成检测需4至6周，需要大量实验室空间和培养箱，试剂成本高，且易受污染。本文介绍一种优化的菌落计数方法——微量化CFU（mCFU），可为分析M.tb疫苗效力结果提供简单而快速的解决方案。mCFU检测所需的试剂用量仅为传统方法的十分之一，培养时间缩短至原来的三分之一，仅需1至2周即可完成，同时减少了实验室空间占用和试剂成本，并显著降低了处理大量M.tb所带来的健康与安全风险。此外，为评估结核病疫苗的效力，样本可能来源于多种途径，包括接种疫苗后感染分枝杆菌的动物组织。我们还描述了一种优化的方法，用于制备单细胞、均一且高质量的分枝杆菌培养物，适用于感染研究。最后，我们建议在结核病疫苗临床前 efficacy 评估研究中普遍采用这些方法，从而最终缩短结核病疫苗的研发周期。

引言

结核病（TB）是全球由单一传染性病原体——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的致死人数最多的疾病，其死亡人数超过任何其他病原体所致疾病。2021年，结核病导致160万人死亡，在2019至2021年新冠大流行期间，其死亡人数仅次于COVID-19¹。此外，根据世界卫生组织2022年全球结核病报告，新冠大流行导致新发结核病病例数增加。世卫组织还报告称，此期间被诊断出结核病的人数大幅下降，这可能导致未来结核病病例数进一步上升¹。

卡介苗（BCG）是一种减毒活疫苗株，来源于致病性分枝杆菌 Mycobacterium bovis，100 多年前首次用作疫苗。这是目前唯一针对结核病的疫苗，也是世界上仍在使用的最古老的获批疫苗^2,3目前，有12种疫苗正处于不同阶段的临床试验中⁴，且有数十种疫苗正处于临床前研发阶段^5,6疫苗的临床前评估包括对其安全性和免疫原性的评价⁷可在....

方案

注意：此处描述的实验方案适用于卡介苗（BCG），但也可应用于其他分枝杆菌。当缺乏生物安全三级（BSL3）设施时，卡介苗可作为结核病实验的替代细菌²²。使用卡介苗的以下操作应在生物安全二级（BSL2）实验室中进行，并遵循针对危害性第二类微生物操作的相应生物安全指南和良好实验室规范。

1. 培养基制备

1. 根据供应商说明，制备添加了10% (v/v) 油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶（OADC）增补剂的Middlebrook 7H9肉汤，并加入0.05% (v/v) 的tyloxapol进行补充。
   注：Tyloxapol是一种非离子型液态聚合物，曾用作表面活性剂以防止细菌聚集成团¹⁶。
2. 根据供应商说明，制备添加了10% (v/v) OADC增补剂的Middlebrook 7H10固体培养基。
3. 每平方培养皿（120 mm × 120 mm）分装40 mL培养基。让培养皿干燥以减少琼脂表面的冷凝现象。
   注：此特定尺寸的培养皿对于直接转移96孔板中的至少96个液滴至关重要。培养皿充分干燥将有助于后续接种少量细菌悬液液滴，并防止液滴扩散。
4. 选用RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute Medium）或DMEM培养基....

结果

此处所述的mCFU实验方法可将单个培养皿中获取的信息量提升至原来的至少96倍。 图5 展示了两种药物递送方法在沙奎那韦（SQV）再利用中的比较^31,32 作为一种宿主导向药物用于治疗结核病。在此实验中，使用了四种不同的菌株 结核分枝杆菌 用于感染原代人巨噬细胞。 M. tuberculosis H37Rv 实验室菌株及三株由葡萄牙国家卫生研究院 Ricardo Jorge 博士研究所（INSA）从活动性结核病患者中分离的临床菌株：一株药物敏感菌株（INSA 编号 33427）、一株多重耐药（MDR）菌株（INSA 编号 34192）和一株广泛耐药（XDR）菌株（INSA 编号 163761）。每种菌株感染后进一步分为八种不同的处理条件，将三种不同浓度的游离药物或脂质体载药与相应的未处理对照组进行比较。最终，每种条件在感染后四个不同时间点进行分析。为定量细胞内细菌生长，每个时间点提取的裂解液总量为 32 份，随后对每份裂解液进行.......

讨论

结核病是一个日益重要的公共卫生问题，尤其在中低收入国家。在新冠大流行期间，结核病诊断和治疗的医疗环境受到干扰，对新发病例的发生率产生了负面影响¹。此外，耐多药和广泛耐药的 M.tb 菌株以及 M.tb 与 HIV 的共感染问题亟需解决，以控制这一流行病^1,34。目前已有多种旨在替代或改进卡介苗（BCG）的新疫苗处于临床试验阶段，未来几年可能有新的疫苗上市³⁵。针对结核病的新疫苗候选物的开发依赖于使用多种动物模型开展的临床前研究。在动物模型中评估疫苗效力需要对感染器官中的细菌负荷进行定量，以证明疫苗的保护效果^5,36。目前已有直接和间接方法用于定量感染小鼠和非人灵长类动物体内的细菌负荷。直接方法包括组织学切片制备以及使用荧光染料金胺-O和齐-尼染色法对细菌进行染色

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔板	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm 镜头	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR 相机	Nikon	D3400
DSLR 微距镜头	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
胎牛血清	Gibco	10270106
Fiji 软件		https://fiji.sc/	Fiji 是一款由多个实验室、机构和个人支持的开源软件，包含所有必需的插件。
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
多通道移液器 (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
多通道移液器 (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	美国典型培养物保藏中心	ATCC35734	菌株 TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC 增补剂	BD	211886
磷酸盐缓冲液 (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 培养基	Gibco	21875091
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
紫外分光光度计 UV-6300PC	VWR	634-6041
方形培养皿 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
超声波清洗仪 Elma P 30 H	VWR	142-0051