Method Article

مضان الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين لتوطين الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر في خلايا الساركوما العظمية البشرية

DOI:

10.3791/65545

⸱

June 16th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة مضان الحمض النووي الريبي في الموقع للتهجين لتوطين lncRNAs في خلايا الساركوما العظمية البشرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت دراسة الأدوار المهمة للحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) في السرطان ، مثل تنظيم الانتشار ، والانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) ، والهجرة ، والتسلل ، والالتهام الذاتي للخلايا السرطانية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا نظرة ثاقبة لوظائفها. من خلال تصميم تسلسل سلسلة مضادات الحساسية الخاصة ب lncRNA متبوعا بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت ، يمكن تطبيق مضان الحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) للكشف عن التوطين الخلوي ل lncRNAs. جنبا إلى جنب مع تطوير الفحص المجهري ، تسمح تقنيات RNA FISH الآن بتصور lncRNAs التي تم التعبير عنها بشكل سيئ. لا يمكن لهذه الطريقة اكتشاف توطين lncRNAs وحدها فحسب ، بل يمكنها أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان. هنا ، قمنا بتضمين إجراء التشغيل التجريبي التفصيلي واحتياطات RNA FISH باستخدام الجين المضيف للحمض النووي الريبي lncRNA الصغير 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية البشرية (143B) كمثال ، لتوفير مرجع للباحثين الذين يرغبون في إجراء تجارب RNA FISH ، وخاصة lncRNA FISH.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد تم توسيع فهمنا للجينوم البشري بشكل كبير من خلال التطورات الحديثة في تكنولوجيا الجينوم الكامل. يمكن نسخ حوالي 93٪ من الجينوم البشري إلى الحمض النووي الريبي ، ولكن يمكن ترجمة 2٪ فقط من الحمض النووي الريبي إلى بروتينات. تسمى 98٪ المتبقية من الحمض النووي الريبي التي ليس لها وظيفة ترجمة البروتين الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNA) 1. كفئة من الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNAs) ، جذبت ncRNAs الطويلة (lncRNAs) ، التي تحتوي على أكثر من 200 نيوكليوتيدات2 ، اهتماما متزايدا بسبب مشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية للخلايا ، مثل التمايز ، والتحكم في الدورة ، وموت الخلايا المبرمج ، والهجرة ، والغزو

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. يوضح الشكل 1 البروتوكول العام لأسماك الحمض النووي الريبي. يحتوي الجدول 1 على تكوين جميع الحلول ويحتوي الجدول 2 على تسلسلات التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد التحقيق

  1. تحديد والحصول على تسلسل FASTA لهدف lncRNA ذي الأهمية ، على سبيل المثال ، من GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). باتباع المؤشرات الموجودة على موقع الويب ، صمم مجسات ISH عبر الإنترنت19 ، وراجع اقتراحات خوارزمية التصميم لسرد المجس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض صور تمثيلية ل SNHG6 FISH في خلايا الساركوما العظمية البشرية (الشكل 2). يتم التعامل مع عنصر التحكم السلبي باستخدام مسبار Ctrl السلبي ؛ يتم التعامل مع التحكم الإيجابي باستخدام مسبار U6 20. يتم تمييز مسبار SNHG6 ومسبار U6 ب Cy3 ، الذي ينبعث منه مضان أحمر. DAPI هي صبغة تلطخ الحمض النووي ، الذي ينبعث منه مضان أزرق. تظهر هذه النتيجة أن SNHG6 موضعي بشكل أساسي في السيتوبلازم ، ويمكن أن توفر هذه المعلومات اتجاها مهما لمزيد من الدراسة ل SNHG6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يمكن لبروتوكول RNA FISH هذا اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها أيضا للكشف عن موقع lncRNAs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المحدد في مثل هذه الحالات يختلف لأن الأنسجة المضمنة في البارافين تحتاج إلى إزالة الشمع21. يمكن تطبيق هذا الإجراء التجريبي في ألواح 48 أو 96 بئرا ، لكن ألواح 384 بئرا صغيرة جدا بحيث لا يمكن استخدامها هنا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل بمنح من (1) البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) ؛ (2) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ؛ (3) مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي للمستشفى ؛ (4) المشاريع البحثية في حدود ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047).

    

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
عداد الخلايا الأوتوماتيكيشنغهاي Simo Biological Technology Co.، LtdIC1000عد الخلايا
لوحة ثقافة الخلية -12Shanghai YueNian Biotechnology Co.، Ltd3513 ، corningضع الغطية في اللوحة
  ؛ خط الخلية (143B)بنك الخلية للأكاديمية الصينية للعلومCRL-8303خط الخلية السرطانية الساركوما العظمية
أنبوب الطرد المركزي (15 مل ، 50 مل)شنغهاي YueNian Biotechnology Co.، Ltd& nbsp ؛ 430790 ، جهاز الطرد المركزي كورنينجالخلايا
Coverslips ShanghaiYueNian Biotechnology Co.، Ltdabs7026يتم زرع الخلايا على الغطاء Cy3
label-SNHG6 مسبار الحمضالنووي شنغهاي GenePharma المحدودةA10005كشف موقع SNHG6
وسائل الإعلام DMEMشنغهاي YueNian التكنولوجيا الحيوية المحدودةLM-E1141حاضنة
حمام جاف متوسطة ثقافة الخليةHaimen Kylin-Bell مختبر الأدوات المحدودةDKT200-2 الحضانة في درجات حرارة عالية مختلفة
الإيثانول 100٪ Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218
مجهر فلورةالجفاف Shanghai Waihai Biotechnology Co.، LTDOlympus BX43 مجهزة بكاميرا Olympus U-TV0.5XC-3 (SN: 5J01719) ، حاضنة أوليمبوسللمراقبة وتحديد المواقع
Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co.، LTDDHP-9051تم تحضين العينات عند 37 درجة مئوية.
تصاعد المتوسطسانغون التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةE675004قم بإرفاق أغطية الشريحة
شاكرHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.، Ltd.TS-8Sالشريحة عينة الغسيل
شنغهاي YueNian التكنولوجيا الحيوية المحدودة188105يتم وضع الغطاء على الشريحة
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.A600198غشاء نفاذية وغشاء نووي
  ؛ التربسين (0.25٪)Shanghai YueNian Biotechnology Co.، Ltd25200056 ، Gibcotrypsin معالجة الخلايا
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.منظفA600560

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA FISHLong Noncoding RNAOsteosarcoma CellslncRNA LocalizationSNHG6 DetectionFluorescence HybridizationCytoplasmic LocalizationDAPI StainingProbe LabelingCell Culture

Related Articles