Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Parkinson hastalığı (PH), orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybına neden olan bir dizi hücre biyolojik süreciyle bağlantılıdır. Mevcut birçok in vitro PD hücresel modeli karmaşıklıktan yoksundur ve çoklu fenotipleri hesaba katmaz. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı mDA nöronlarındaki fenotipik profilleme, PD ile ilgili bir hücre tipinde bir dizi nöronal fenotipi paralel olarak aynı anda ölçerek bu eksiklikleri giderebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen insan mDA nöronlarından fenotipik profiller elde etmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Nükleer, α-sinüklein, Tirozin hidroksilaz (TH) ve Mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) ile ilgili fenotipleri görselleştirmek için nörona özgü bir floresan boyama paneli kullanılır. Açıklanan fenotipik profilleme protokolü, 384 oyuklu plakalar, otomatik sıvı işleme ve yüksek verimli mikroskopi kullandığından ölçeklenebilir. Protokolün faydası, Lösin açısından zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) geninde PD'ye bağlı G2019S mutasyonunu taşıyan sağlıklı donör mDA nöronları ve mDA nöronları kullanılarak örneklendirilmiştir. Her iki hücre hattı da LRRK2 kinaz inhibitörü PFE-360 ile tedavi edildi ve fenotipik değişiklikler ölçüldü. Ek olarak, çok boyutlu fenotipik profillerin kümeleme veya makine öğrenimine dayalı denetimli sınıflandırma yöntemleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini gösteriyoruz. Açıklanan protokol, özellikle nöronal hastalık modellemesi üzerinde çalışan veya insan nöronlarındaki kimyasal bileşik etkilerini inceleyen araştırmacıların ilgisini çekecektir.
Giriş
Parkinson hastalığında (PH) çeşitli hücre biyolojik süreçleri bozulur. Örneğin, mitokondriyal disfonksiyon, oksidatif stres, protein yıkım kusurları, veziküler kaçakçılığın bozulması ve endolizozomal fonksiyon, orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybı ile ilişkilendirilmiştir ve PD1'de yaygın olarak gözlenir. Bu nedenle, PH, birbiriyle etkileşime girebilen ve birbirini kötüleştirebilen çoklu hastalık mekanizmalarını içeriyor gibi görünmektedir. Bu mekanik etkileşimi araştırmanın yararlı bir yolu, kapsamlı bir fenotipik parmak izinin veya orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlarının profilinin oluşturulmasıdır.
Fenotip....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Nöron tohumlaması için besiyeri ve plakaların hazırlanması (1. Gün)
- Plakaları Gün-1'de nöron tohumlamasına hazırlamak için, kullanmadan hemen önce Laminin'i oda sıcaklığına (RT) ısıtın. Laminin stok çözeltisini (0.1 mg / mL) soğuk PBS + / + (Ca 2 + ve Mg2 + ile) 1/10 oranında seyrelterek Laminin çözeltisini hazırlayın.
NOT: Tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Çözeltilerin ve tamponların bileşimleri Tablo 1-4'te açıklanmıştır. - Daha sonra, önceden kaplanmış 384 oyuklu bir Poli-D-Lizin (PDL) plakasının her bir oyuğuna 25 μL Laminin çözeltisi ekleyin ve gece bo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
mDA nöronlarında fenotipik profilleme, hücresel biyolojinin birçok yönünü ve deneysel modülasyon sırasındaki değişikliklerini ölçmenin etkili bir yoludur. Bu metodolojiyi örneklemek için, bu çalışmada kriyoprezervasyonlu LRRK2 G2019S ve sağlıklı donör mDA nöronları kullanılmıştır. Bu nöronlar yaklaşık 37 gündür farklılaşmıştır, post-mitotik ve eksprese nöronal belirteçlerdir (TUBB3 ve MAP2) ve FOXA2 ile kombinasyon halinde tirozin hidroksilaz (TH) dahil olmak üzere dopaminerjik nöron belirteçleridir, glial belirteç Glial.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fenotipik profilleme, floresan boyama, mikroskopi ve görüntü analizi uygulayarak hücrelerdeki çok sayıda fenotipi ölçmek için kullanılan bir tekniktir3. Fenotipik profiller, hücresel biyolojide tek bir okuma kullanıldığında fark edilmeyebilecek karmaşık değişiklikleri anlamak için hücre hatları veya diğer deneysel koşullar arasında elde edilebilir ve karşılaştırılabilir. Burada, PD hücresel biyolojisini modellemek için sıklıkla kullanılan bir hücre tipi olan insan iPSC'den türetilmiş mDA nöronları.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar Ksilink tarafından istihdam edilmektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, sunulan protokolün tasarımına yol açan değerli yardımları ve tartışmaları için Ksilink'teki tüm meslektaşlarına teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-tavuk – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | İmmünofloresan |
| Anakonda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | İmmünofloresan |
| Anti-fare - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | İmmünofloresan |
| Anti-tavşan - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | İmmünofloresan |
| Anti-Tirozin | Hidroksilaz | Merck T2928 | İmmünofloresan |
| Anti-&alfa;-sinüklein | Abcam | 138501 | İmmünofloresan |
| Bravo 384ST kafa Agilent | Sıvı işleyici yoksa, elektronik çok kanallı pipet kullanılması önerilir. | ||
| Konfokal mikroskop | Yokogawa | CV7000 | Görüntü kalitesi tutarlılığını sağlamak için otomatik bir konfokal floresan mikroskobu kullanılması önerilir. |
| Kontes Otomatik hücre sayacı | Invitrojen | Tohumlamadan önce hücre sayımı. Manuel bir sayma odası kullanılarak da yapılabilir. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Yıkama Dispenseri için Tampon |
| nbsp; | BioTek (Agilent) | Sıvı işleyici yoksa, elektronik çok kanallı pipet kullanılması önerilir. | |
| Formaldehit Çözeltisi (PFA %16) | Euromedex | EM-15710-S | Boyama öncesi fiksasyon |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nükleer boyama |
| iCell Baz Ortamı 1 | Fujifilm | M1010 | Nöronlar için temel ortam |
| iCell DPN, Donör # 01279, Fenotip AHN, lot # 106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Görünüşe göre sağlıklı donör |
| iCell DPN, Donör # 11299, Fenotip LRRK2 G2019S, fenotip PD lot # 106139 | Fujifilm | C1149 | LRRK2 G2019S mutasyonu taşıyan donör |
| iCell Sinir Sistemi Takviyesi | Fujifilm | M1031 | Temel ortam için |
| iCell Nöral Ek B | Fujifilm | M1029 | Temel ortam |
| Jupyter Python Notebook | Ham verilerden fenotipik profil görselleştirme ve sınıflandırma gerçekleştirmek için | şirket içi geliştirme | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plaka kaplama |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinaz inhibitörü |
| PhenoLink | analizi için | şirket içi geliştirme | https://github.com/Ksilink/PhenoLink |
| PhenoPlate 384w, PDL kaplı | Perkin Elmer | 6057500 | Hücre kültürü ve görüntüleme için önceden kaplanmış plaka. Bu plaka, Yokogawa CV7000 mikroskobunun tüm amaçlarını kullanarak tüm kuyucukların görüntülenmesini sağlar. |
| Depolama plakaları Abgene 120 & mikro; L | Thermo Scientific | AB-0781 | Vprep pipetleme sistemi kullanılarak bileşik dağıtım için gereklidir. Mevcut değilse, elektronik çok kanallı pipet kullanılması önerilir. |
| Triton | Sigma | T9284 | Lizis öncesi geçirgenlik |
| Tripan Mavi | Sigma | T8154-20ML | Canlı hücrelerin belirlenmesi |
| Vprep Pipetleme Sistemi | Agilent | Ortam değişimi ve bileşik dağıtımı. Alternatif olarak, elektronik çok kanallı bir pipet kullanılabilir. |
Kaynaklar
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
