在此，我们介绍一种可靠的实验方法 原位 通过灌注小鼠肝脏，在不破坏肝脏结构但排除肝外因素干扰的条件下，研究肝脏代谢的急性与直接调控机制。
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本文内容
摘要
摘要
肝脏具有多种功能，包括营养物质代谢。与其他器官相比 体外 和 体内 肝脏研究模型中，离体灌注肝脏技术可在完整肝组织结构条件下，将肝脏与肝外因素的影响相分离，从而对整个肝脏的生物学特性及代谢过程进行研究。肝脏灌注技术最初为大鼠建立，但该方法也已成功应用于小鼠。本文描述了一种小鼠离体肝脏灌注的实验方案 原位 小鼠肝脏灌流。通过门静脉顺行灌流含氧的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液，并夹闭肝下下腔静脉，从肝上下腔静脉收集流出液，以形成闭合回路。利用该方法，可对受试化合物的直接肝脏效应进行高时间分辨率的详细评估。肝脏功能和活性至少可稳定维持3小时，允许在同一实验中设置内部对照。该模型具有广泛的实验应用潜力，有助于深入理解肝脏生理学及肝脏疾病机制。
引言
肝脏是代谢过程中的重要器官，通过调节葡萄糖、脂质和氨基酸代谢，在全身能量平衡的调控中发挥关键作用。全球范围内肝脏疾病的增加正成为一项重大的公共卫生负担，迫切需要进一步了解其病理生理机制及其对肝脏功能的影响。
各种 体外 已开发出多种模型用于肝脏研究，以作为补充 体内 研究中广泛使用从啮齿类动物和人类分离并培养的原代肝细胞。利用差速离心和梯度离心可将非实质细胞与肝细胞分离，不同类型细胞的共培养对于研究细胞间相互作用具有重要意义。1尽管原代人肝细胞被认为是检测药物毒性的金标准，但多项研究表明，这些肝细胞在组织培养中会迅速去分化，导致肝功能丧失2,3,4. 三维球状体系统中的肝细胞培养可改善去分化现象，具有更高的稳定性，并且更接近模拟肝脏功能 体内 比传统的二维培养系统更高程度5精密切割肝组织片是另一种成熟的方法 体外 保持肝脏组织结构完整并包含肝脏中非实质细胞的模型6更高级的 体外 模型包括肝脏芯片7 和肝类器官
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方案
所有动物实验均获得丹麦动物实验监察局、丹麦环境与食品部（许可证号：2018-15-0201-01397）以及当地伦理委员会的批准，符合欧盟指令2010/63/EU、美国国立卫生研究院（出版物编号85-3）以及丹麦关于动物实验的立法（1987年）的规定。本实验为终点性操作，动物在深度麻醉下通过放血和膈肌穿刺致死。
1. 实验动物
- 获取所需品系、年龄和性别的小鼠。本研究使用11至16周龄的雄性C57BL/6JRj小鼠。每笼饲养不超过5只雄性或8只雌性小鼠，自由摄食和饮水，维持12小时光照/12小时黑暗循环，光照时间为上午6点至下午6点。
2. 术前准备
- 配制肝脏灌注缓冲液。
- Krebs-Henseleit 缓冲液。混合并溶解 118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO₄·7H₂O、1.2 mmol/L KH₂PO₄、25 mmol/L NaHCO₃、11 mmol/L 葡萄糖和 2.5 mmol/L CaCl₂·2H₂O。4，以及 1.2 mmol/L KH2PO4 在 dH₂O 中2O. 溶解 1.25 mmol/L CaCl....
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结果
为了确定某种刺激物或底物是否引起目标分子的释放，必须具备稳定的基线。图3A展示了一项成功实验的示例。灌注肝脏中尿素的生成以每2分钟为间隔进行测定，结果以均值±标准误（SEM）表示。每次刺激前的基线期均保持稳定。图3B显示了两次刺激期间及其相应基线期的平均尿素生成量。各时间段之间的统计学差异采用重复测量单因素方差分析（one-way ANOVA）进行检验。根据这些结果可以得出结论：连续两次使用混合氨基酸刺激所引发的尿素反应相似，这一结果是评估不同剂量或测试化合物重复刺激效应时重要的对照实验。
除了尿素生成外，还可利用上述方案研究肝脏糖原分解和脂解作用。图3C-F展示了另一项实验中胰高血糖素输注期间的数据。葡萄糖.......
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讨论
离体灌注小鼠肝脏是研究肝脏代谢动态变化及分子机制的强有力研究工具。其能够实现分钟级取样，从而详细评估待测化合物对肝脏的直接作用。与 在 活体研究中，灌注肝脏使我们能够以隔离方式研究肝脏代谢，避免血液携带的肝外因素干扰，并对实验条件实现完全控制。与之相比，肝脏灌注的优势在于 体外 使用分离肝细胞的研究中，肝脏灌注的优势在于能够维持肝脏的结构完整性、细胞极性、分区特征以及血管系统的完整。另一个优势是灌注液样本量较大（3.5 mL/min），可在同一样本中检测多个指标。然而，在研究依赖转录调控效应时，灌注肝脏模型并非理想选择，因为此类机制可能需要数小时才能显现。除代谢研究外，该方案还可应用于其他研究领域，用于探讨肝脏的内分泌功能（如激素和肝源性因子的分泌）以及肝脏对药物和外源性物质的代谢。
该方法最关键的步骤是将导管放置于门静脉内。导管尖端必须准确定位于门静脉分为左右肝门静脉分支之前的部位（图2）。如果导管插入过深，则仅有部分肝脏能够得到充分灌注；若导管位置过于靠近门静脉远端，则可能发生经胰十.......
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披露
作者声明本文不存在相关利益冲突。
致谢
本研究由诺和诺德基金会卓越新兴研究者资助——内分泌学与代谢（申请号 NNF19OC0055001）、欧洲糖尿病研究基金会未来领袖奖（NNF21SA0072746）以及丹麦独立研究基金，Sapere Aude（1052-00003B）提供支持。诺和诺德基金会蛋白质研究中心的经费由诺和诺德基金会提供（资助协议号 NNF14CC0001）。图1B使用biorender.com制作。 我们感谢诺和诺德公司（Novo Nordisk A/S）的Rune E. Kuhre博士在灌流小鼠肝脏实验方面的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三通旋塞阀 | BD | 394601 | |
| Altromin 繁殖饲料 | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Sigma | C8106 | |
| 导管（0.7 mm） | BD | 381812 | |
| 滤纸（孔径 2.0 µm） | Millipore | AP2029325 | |
| 葡萄糖检测试剂盒 | QuantiChromTM | DIGL-100 | 低浓度方案 |
| 氯胺酮 | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| 结扎线（黑色无菌丝线） | Agnthos | 14739 | |
| 硫酸镁（MgSO4） | Sigma | 230391 | |
| 非酯化脂肪酸检测试剂盒 | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| 加热式手术台，三脚架支架，型号 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma | P9541 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Merck | 1.04877 | |
| 滚柱泵，四通道 | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| 医用胶带 | Mediq danmark | 4001910 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Sigma | S5761 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S1679 | |
| 恒温循环器 | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | 浴槽体积 3 L，230 V/50 Hz |
| 管路 | Tygon | E3603 | 内径 1.59 mm，外径 3.18 mm |
| 通用灌流系统 | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | 基本单元 uniper UP-100，型号 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | 混合氨基酸 |
| 血管夹适配器 | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| 血管夹 | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| 赛拉嗪 | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
参考文献
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329(2016).
- Lauschke, V. M., et al.
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重印与许可
