Hier presenteren we een affiniteitszuiveringsmethode van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus die eenvoudig, goedkoop en efficiënt is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Affiniteitszuivering van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het fibrinolytische enzym van Sipunculus nudus (sFE) is een nieuw fibrinolytisch middel dat zowel plasminogeen tot plasmine kan activeren als fibrine direct kan afbreken, wat grote voordelen biedt ten opzichte van traditionele trombolytische middelen. Vanwege het gebrek aan structurele informatie zijn alle zuiveringsprogramma's voor sFE echter gebaseerd op meerstapschromatografiezuiveringen, die te ingewikkeld en duur zijn. Hier wordt voor het eerst een affiniteitszuiveringsprotocol van sFE ontwikkeld op basis van een kristalstructuur van sFE; het omvat de bereiding van het ruwe monster en de lysine/arginine-agarose matrix affiniteitschromatografiekolom, affiniteitszuivering en karakterisering van de gezuiverde sFE. Volgens dit protocol kan een partij sFE binnen 1 dag worden gezuiverd. Bovendien neemt de zuiverheid en activiteit van de gezuiverde sFE toe tot respectievelijk 92% en 19.200 U/ml. Dit is dus een eenvoudige, goedkope en efficiënte aanpak voor sFE-zuivering. De ontwikkeling van dit protocol is van groot belang voor het verdere gebruik van sFE en andere soortgelijke middelen.
Inleiding
Trombose is een grote bedreiging voor de volksgezondheid, vooral na de Covid-19 wereldwijde pandemie 1,2. Klinisch gezien zijn veel plasminogeenactivatoren (PA's), zoals weefseltype plasminogeenactivator (tPA) en urokinase (VK), op grote schaal gebruikt als trombolytische geneesmiddelen. PA's kunnen plasminogeen van patiënten activeren tot actief plasmine om fibrine af te breken. Hun trombolytische efficiëntie wordt dus sterk beperkt door de plasminogeenstatus van de patiënten 3,4. Fibrinolytische middelen, zoals metalloproteinase plasmine en serine plasmine, zijn een ander type klinisch trombolytisch geneesmiddel dat ook fibrinolytische enzymen (FE) zoals plasmine bevat, die stolsels direct kunnen oplossen, maar snel worden geïnactiveerd door verschillende plasmineremmers5. Vervolgens is een nieuw type fibrinolytisch middel gemeld dat de trombus kan oplossen door niet alleen het plasminogeen in plasmine te activeren, maar ook het fibrine direct af te breken 6-het fibrinolytische enzym van de oude pindamur Sipunculus nudus (sFE)6. Deze bifunctie geeft sFE andere voordelen ten opzichte van traditionele trombolytische geneesmiddelen, vooral in termen van abnormale plasminogeenstatus. In vergelijking met andere bifunctionele fibrinolytische middelen 7,8,9 vertoont sFE verschillende voordelen, waaronder veiligheid, ten opzichte van van non-food afgeleide middelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, met name voor orale geneesmiddelen. Dit komt omdat de bioveiligheid en biocompatibiliteit van Sipunculus nudus goed zijn vastgesteld10.
Net als de andere natuurlijke fibrinolytische middelen geïsoleerd uit micro-organismen, regenwormen en paddenstoelen, is de zuivering van sFE uit S. nudus zeer gecompliceerd en omvat meerdere stadia, zoals weefselhomogenisatie, ammoniumsulfaatprecipitatie, ontzilting, anionenuitwisselingschromatografie, hydrofobe interactiechromatografie en moleculair zeven10,11,12. Een dergelijk zuiveringssysteem is niet alleen afhankelijk van bekwame vaardigheden en dure materialen, maar vereist ook enkele dagen om de hele procedure te voltooien. Daarom is een eenvoudig zuiveringsprogramma van sFE van groot belang voor de verdere ontwikkeling van sFE. Gelukkig zijn er twee kristallen van sFE (PDB: 8HZP; VOB: 8HZO) met succes zijn verkregen (zie aanvullend dossier 1 en aanvullend dossier 2). Door middel van structurele analyse en moleculaire dockingexperimenten ontdekten we dat de katalytische kern van sFE specifiek kon binden aan doelen die arginine of lysineresiduen bevatten.
Hierin werd voor het eerst een affiniteitszuiveringssysteem voorgesteld, gebaseerd op de kristalstructuur van sFE. Door dit protocol te volgen, kon zeer zuivere en zeer actieve sFE worden gezuiverd uit de ruwe extracten in een enkele affiniteitszuiveringsfase. Het hier ontwikkelde protocol is niet alleen belangrijk voor de grootschalige bereiding van sFE, maar kan ook worden toegepast voor de zuivering van andere fibrinolytische middelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding
- Monsterbehandeling
- Ontleed voorzichtig verse S. nudus (100 g) en verzamel de darm en zijn binnenvocht.
- Voeg 300 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4) toe voor homogenisatie (1.000 tpm, 60 s).
- Bevries-ontdooi het homogenaat 3x.
- Centrifugeer het monster (10,956 × g, 0,5 uur, 4 °C) en verzamel het supernatant. Bewaar het monster bij 4 °C tot verder gebruik.
- Neerslag van eiwitten
- Meng het supernatant met de verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (negen volumes) en laat het mengsel 12 uur bij 4 °C staan.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en later worden voortgezet. - Centrifugeer (10,956 × g, 0,5 uur, 4 °C) om het eiwitprecipitaat te verkrijgen; bewaren bij 4 °C voor later gebruik.
- Meng het supernatant met de verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (negen volumes) en laat het mengsel 12 uur bij 4 °C staan.
- Eiwitresuspensie
- Resuspendeer het eiwitprecipitaat met 30 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4). Bewaar deze ruwe eiwitoplossing bij 4 °C voor later gebruik.
2. Affiniteitschromatografie
- Filtratie van oplossingen
- Filtreer de ruwe eiwitoplossing door een filtermembraan van 0,22 μm. Bewaar dit monster bij 4 °C voor later gebruik.
- Kolom verpakking
- Verpak de arginine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom en lysine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom door een geschikte hoeveelheid lysine-agarose matrix medium en arginine-agarose matrix medium in 5 ml lege chromatografie kolommen te laden.
OPMERKING: De kolom kan worden bewaard bij 2-8 °C, waarbij de matrix wordt ondergedompeld in de opslagbuffer (20% ethanol).
- Verpak de arginine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom en lysine-agarose matrix affiniteitschromatografie kolom door een geschikte hoeveelheid lysine-agarose matrix medium en arginine-agarose matrix medium in 5 ml lege chromatografie kolommen te laden.
- Affiniteitszuivering
- Breng de affiniteitschromatografiekolom eerst in evenwicht met ddH2O (1 ml/min, 10 kolomvolumes), gevolgd door Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 kolomvolumes).
- Laad het eiwitoplossingsmonster op de vooraf gebalanceerde kolom (1 ml/min, 1/3 kolomvolume).
OPMERKING: Het volume van de monsterbelasting is afhankelijk van de concentratie van sFE. - Was de kolom met Tris-HCl buffer (0,02 M, pH 8,0, vijf kolomvolumes).
- Elueer de kolom met achtereenvolgens 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M en 0,65 M NaCl (1 ml/min, vijf kolomvolumes).
- Zoek naar de elutiepiek die zou moeten verschijnen in de 0,15 M NaCl-elutie en verzamel vervolgens de fracties in buisjes van 5 ml.
- Concentreer het elutiemonster met een ultracentrifugaalfilter van 3 kD (3,944 × g, 1,5 uur, 4 °C). Bewaar dit monster bij -80 °C voor later gebruik.
3. Zuiverheidsbeoordeling
- Natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel preparaat
- Bereid de SDS-PAGE gel volgens de methode van Laemmli met 5% geconcentreerde gel en 12% scheidingsgel13.
- Elektroforese
- Meng het monster (15 μL) met 5x SDS-PAGE eiwitlaadbuffer (1/4 volume), verwarm gedurende 5 minuten in kokend water, laad op de SDS-PAGE-gel en laat de gel gedurende 1,5 uur op 80 V, 60 mA lopen.
- Analyse
- Na elektroforese kleurt u de gel met een Silver Stain Kit, volgens het protocol van de fabrikant, en observeert u de gekleurde gel met behulp van een chemiluminescent beeldvormingssysteem.
- Analyseer de zuiverheid van het doeleiwit met behulp van de volgende formule: zuiverheid van doeleiwit = intensiteitswaarde van doeleiwit/intensiteitswaarde van totaal eiwit.
4. Fibrinolytische activiteitsevaluatie
- Fibrine plaat voorbereiding
- Bereid de fibrinogeenoplossing door 25 mg fibrinogeen te mengen met 1,25 ml fysiologische zoutoplossing.
- Bereid de trombine-oplossing door 100 U trombine volledig te mengen met 1,05 ml fysiologische zoutoplossing.
- Bereid de agarose-oplossing door 0,5 g agarose toe te voegen aan 22,5 ml Tris-HCl-buffer (0,02 mol/l, pH 7,4). Meng en verwarm de agarose-oplossing op 100 °C totdat deze volledig is opgelost.
- Koel de agarose-oplossing af tot ongeveer 50 °C en voeg fibrinogeenoplossing toe. Voeg vervolgens onmiddellijk de trombine-oplossing toe, meng ze snel en giet ze in een kweekschaal van 60 mm.
- Laden
- Pons met een steriele boor kuilen van 3 mm op de bereide fibrineplaten en vul de putjes met 10 μL-monsters.
- Analyse
- Meet na 18 uur incubatie bij 37 °C de fibrinolytische activiteit door de grootte van hun afbraakzones te berekenen. Fibrinolytische activiteit = (zonegrootte van het monster/zonegrootte van urokinase) x 100 U. Zonegrootte = diameter x diameter.
OPMERKING: Fysiologische zoutoplossingbuffer, ruw eiwit (monster verkregen in protocolstap 1.3.1) en urokinase werden gebruikt voor respectievelijk de blanco, negatieve controle en positieve controle. In vergelijking met urokinase vonden we dat de fibrinolytische activiteit van de gezuiverde sFE ~ 19.200 U / ml was.
- Meet na 18 uur incubatie bij 37 °C de fibrinolytische activiteit door de grootte van hun afbraakzones te berekenen. Fibrinolytische activiteit = (zonegrootte van het monster/zonegrootte van urokinase) x 100 U. Zonegrootte = diameter x diameter.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens dit protocol werden ruwe weefsellysaten geëxtraheerd, arginine-agarose matrix en lysine-agarose matrix affiniteitschromatografiekolommen gebouwd, gezuiverde sFE verkregen en de zuiverheid en fibrinolytische activiteit van de gezuiverde sFE werden gemeten door respectievelijk SDS-PAGE en fibrineplaten.
Na centrifugatie was het verzamelde supernatant een transparante bruine viskeuze vloeistof. Precipitatie begon toen dit supernatant werd gemengd met verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (n...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vanwege de onbeschikbaarheid van de exacte gensequentie van sFE, werd de momenteel gebruikte sFE geëxtraheerd uit verse S. nudus14. Bovendien waren de zuiveringsprocedures van sFE die in de literatuur werden gerapporteerd gecompliceerd en kostbaar, omdat ze gebaseerd waren op enkele algemene kenmerken van sFE, zoals molecuulgewicht, iso-elektrisch punt, ionische sterkte en polariteit15,16. Tot op heden is er geen affiniteitszuiver...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Science and Technology Bureau van Xiamen City (3502Z20227197) en het Science and Technology Bureau van de provincie Fujian (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
Referenties
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
