הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65631

⸱

2 ביוני 2023

 ,  ,  , 
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.

תקציר

האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.

מבוא

פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית 1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגןשל החולים 3,4. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות אך מושבתים במהירות על ידי מעכבי פלסמין שונים5. לאחר מכן, דווח על סוג חדש של סוכן פיברינוליטי שיכול להמיס את הפקקת לא רק על ידי הפעלת הפלזמינוגן לפלסמין, אלא גם פירוק הפיברין ישירות 6-האנזים הפיברינוליטי מתולעת הבוטנים העתיקה Sipunculus nudus (sFE)6. דו-תפקודי זה מעניק ל-sFE יתרונות נוספים על פני תרופות טרומבוליטיות מסורתיות, במיוחד במונחים של מצב פלסמינוגן חריג. בהשוואה לחומרים פיברינוליטיים דו-תפקודיים אחרים 7,8,9, sFE מציג מספר יתרונות, כולל בטיחות, על פני חומרים שאינם נגזרים ממזון לפיתוח תרופות, במיוחד עבור תרופות דרך הפה. הסיבה לכך היא שהבטיחות הביולוגית והתאימות הביולוגית של Sipunculus nudus התבססו היטב10.

בדומה לחומרים פיברינוליטיים טבעיים אחרים שבודדו ממיקרואורגניזמים, תולעי אדמה ופטריות, טיהור sFE מ-S. nudus הוא מסובך מאוד וכולל שלבים מרובים, כגון הומוגניזציה של רקמות, משקעים של אמוניום סולפט, התפלה, כרומטוגרפיה של חילופי אניון, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית וניפוי מולקולרי10,11,12. מערכת טיהור כזו לא רק תלויה במיומנויות מיומנות וחומרים יקרים, אלא גם דורשת מספר ימים כדי להשלים את כל ההליך. לכן, תוכנית טיהור פשוטה של sFE היא בעלת משמעות רבה לפיתוח נוסף של sFE. למרבה המזל, שני גבישים של sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) הושגו בהצלחה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). באמצעות ניתוח מבני וניסויי עגינה מולקולרית, מצאנו כי הליבה הקטליטית של sFE יכולה להיקשר באופן ספציפי למטרות המכילות שאריות ארגינין או ליזין.

כאן הוצעה לראשונה מערכת טיהור זיקה, המבוססת על המבנה הגבישי של sFE. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לטהר sFE טהור מאוד ופעיל מאוד מהתמציות הגולמיות בשלב טיהור זיקה יחיד. הפרוטוקול שפותח כאן חשוב לא רק להכנת בקנה מידה גדול של sFE, אלא גם עשוי להיות מיושם לטיהור של סוכנים פיברינוליטיים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה

  1. טיפול לדוגמה
    1. בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.
    2. הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).
    3. להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.
    4. צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופרנטנט. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
  2. משקעים חלבוניים
    1. מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולהמשיך אותו מאוחר יותר.
    2. צנטריפוגה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את משקע החלבון; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
  3. תרחיף חלבונים
    1. להשהות מחדש את משקע החלבון עם 30 מ"ל של מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4). אחסנו את תמיסת החלבון הגולמי בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.

2. כרומטוגרפיית זיקה

  1. סינון פתרונות
    1. סנן את תמיסת החלבון הגולמי דרך קרום מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן דגימה זו בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
  2. אריזת עמודות
    1. ארוז את עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז ואת עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין-אגרוז על ידי טעינת כמות מתאימה של מדיום מטריצת ליזין-אגרוז ומדיום מטריצת ארגינין-אגרוז לעמודות כרומטוגרפיה ריקות של 5 מ"ל.
      הערה: ניתן לאחסן את העמודה בטמפרטורה של 2-8°C, כאשר המטריצה שקועה במאגר האחסון (20% אתנול).
  3. טיהור אהדה
    1. אזן את עמודת כרומטוגרפיית הזיקה עם ddH2O תחילה (1 מ"ל/דקה, 10 כרכים של עמודות), ואחריו מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, 1 מ"ל/דקה, 5 אמצעי אחסון).
    2. טען את דגימת תמיסת החלבון על העמודה המאוזנת מראש (1 מ"ל/דקה, נפח של 1/3 עמודה).
      הערה: נפח טעינת הדגימה תלוי בריכוז sFE.
    3. שטוף את העמודה באמצעות מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, חמישה כרכי עמודות).
    4. הצביעו על העמוד ברצף באורך 0.15 מ', 0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' NaCl (1 מ"ל/דקה, חמישה כרכי עמודות).
    5. חפש את שיא האלוציה שאמור להופיע ב- 0.15 M NaCl elution, ולאחר מכן אסוף את השברים בצינורות 5 מ"ל.
    6. רכז את דגימת האלוציה באמצעות מסנן אולטרה צנטריפוגלי 3 kD (3,944 × גרם, 1.5 שעות, 4 ° C). אחסן דגימה זו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.

3. הערכת טוהר

  1. נתרן דודציל-סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל הכנה
    1. הכינו את ג'ל SDS-PAGE לפי השיטה של Laemmli באמצעות 5% ג'ל מרוכז ו-12% ג'ל הפרדה13.
  2. אלקטרופורזה
    1. ערבבו את הדגימה (15 מיקרוליטר) עם מאגר העמסת חלבון 5x SDS-PAGE (1/4 נפח), חממו במים רותחים למשך 5 דקות, טענו על ג'ל SDS-PAGE והפעילו את הג'ל במתח של 80 וולט, 60 מיליאמפר למשך שעה וחצי.
  3. ניתוח
    1. לאחר אלקטרופורזה יש לצבוע את הג'ל בערכת כתמים כסופה, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ולצפות בג'ל המוכתם באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית.
    2. נתח את טוהר חלבון המטרה באמצעות הנוסחה הבאה: טוהר חלבון המטרה = ערך העוצמה של חלבון המטרה / ערך העוצמה של סך החלבון.

4. הערכת פעילות פיברינוליטית

  1. הכנת צלחת פיברין
    1. הכן את הפתרון פיברינוגן על ידי ערבוב 25 מ"ג של פיברינוגן עם 1.25 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.
    2. הכן את פתרון תרומבין על ידי ערבוב מלא 100 U של תרומבין עם 1.05 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.
    3. הכן את תמיסת האגרוז על ידי הוספת 0.5 גרם אגרוז ל 22.5 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.4). מערבבים ומחממים את תמיסת האגרוז ב-100°C עד להמסה מלאה.
    4. מצננים את תמיסת האגרוז עד לסביבות 50°C ומוסיפים תמיסת פיברינוגן. לאחר מכן, מיד להוסיף את פתרון טרומבין, לערבב אותם במהירות, ויוצקים אותם לתוך צלחת תרבית 60 מ"מ.
  2. טעינת
    1. ניקבו בארות 3 מ"מ על לוחות הפיברין המוכנים באמצעות בורר סטרילי ומלאו את הבארות בדגימות 10 μL.
  3. ניתוח
    1. לאחר 18 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, למדוד את הפעילות הפיברינוליטית על ידי חישוב גודל האזורים השפלה שלהם. פעילות פיברינוליטית = (גודל אזור הדגימה / גודל אזור האורוקינאז) x 100 U. גודל אזור = קוטר x קוטר.
      הערה: חיץ מלח פיזיולוגי, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בשלב פרוטוקול 1.3.1) ואורוקינאז שימשו לבקרה הריקה, השלילית והחיובית, בהתאמה. בהשוואה לאורוקינאז, מצאנו כי הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהר הייתה ~ 19,200 U/mL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.

לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. המשקעים החלו כאשר סופרנאטנט זה עורבב עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים). לאחר עמידה של 12 שעות, נוצר שקע כבד בתחתית הצינור. כאשר הוא הושעה מחדש עם חיץ Tris-HCl, המשקע החלבוני נעלם במהירות והתמוסס בחיץ, והופיע כנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus14 טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות15,16. עד כה לא דווח על פרוטוקול טיהור זיקה של sFE. במחקר זה, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח בהצלחה בהתבסס על הידע של המבנה הגבישי שלו. בהשוואה לשיטות הטיהור המדווחות, שיטת טיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197) ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
30% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד (29:1)Biosharp
2-MercaptoethanolSolarbio
Agarose G-10Biowest
אמוניום פרסולפטSINOPHARM
אמוניום סולפטSINOPHARM
ארגינין-ספרוז 4BSolarbioArginine-agarose matrix
ברומוקסילנול כחול (BPB)Solarbio
Fast Silver Stain KitBeyotime
FibrinogenMerck
GlycineSolarbio
חומצה הידרוכלוריתSINOPHARM
KinaseRHAWN
ליזין-ספרוז 4BSolarbioליזין-אגרוז
N,N,N',N'-טטרמתילאתילנדיאמין (TEMED)מוכתם-סיגמא-אולדריץ
(10-170 kD)ביוטיים
נתרן כלוריסינופארם
נתרן דודציל סולפונאט (SDS)סיגמא-אולדריץ
' נתרן הידרוקסידSINOPHARM
תרומביןמיילונביו
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאןסולארביו
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלורידסולארביו
<חזק>ציוד
AKT מערכת טיהור חלבון GE
טהורמעקר קיטור בלחץ אנכי אוטומטי MLS-3750SANYO
מערכת הדמיה כימילומינסנציהGE
משאבת זרימה קבועה BT-100QITE
חממת טמפרטורה קבועהJINGHONG
צנטריפוגה מקוררת שולחנית 3-30KSSIGMA
DHG DGG-9140ADSENXIN
הומוגנייזר זכוכית חשמלית DY89-IISCIENTZ
איזון אנליטי אלקטרוניDENVER
אמבט מים אלקטרו-תרמוסטטי DK-S12SENXIN
שייקר אופקי להסרת צבעקיילין-בל
AF 103סקוטי
KQ-500E מנקה אולטרסאונדShuMei
בוחש מגנטיZhi wei
צנטריפוגה מיקרו מקוררת H1650-WCence
תנור מיקרוגלGalanz
Milli-Q התייחסותMillipore
PipettorThermo Fisher Scientific
מד pH שולחני מדויק
מתנד מערבולת בגודל קטןKylin-Bell
מערכת אלקטרופורזה אנכיתביו-רד
<חזק>חומר מתכלה 
200 ומיקרו; צינור L PCR (200 ומיקרו; L)Axygene
(1.5 מ"ל)
(5 מ"ל)
(50 מ"ל)
(7 מ"ל)Biosharp
(60 מ"מ)NEST
(0.22 & מיקרו; m)Millex GP
ParafilmBemis
Pipette Tip Tip (1 מ"לKIRGEN
Pipette Tip (10 ומיקרו; L)Axygene
(200 ומיקרו; L)של Axygene
יחידת מסנן אולטרה צנטריפוגלי TZAKZY
(4 מ"ל 3 KDa)מגיב
מטריצת סמן חלבון צבע ' תנור חימום וייבוש מסדרת מכונת קרח צינור צנטריפוגה צינור צנטריפוגה Biosharp צינור צנטריפוגה Biosharp צינור צנטריפוגה NEST צלחת תרבית קרום מסנן ) קצה פיפטה נייר אינדיקטור מיוחד (15 מ"ל 3 KDa)יחידת מסנן אולטרה צנטריפוגלית Millipore SSS מחוון pH אוניברסלי של Millipore

מקורות

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).
  11. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

שקיעת חלבוניםארגינין-אגרוזליזין-אגרוזכרומטוגרפיית זיקהבדיחת לוח פיבריןאלואציה במדרגהפעילות פיברינולית
זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.