En este artículo se presenta la aplicación de un método de detección de baja frecuencia basado en la secuenciación de Sanger en el linfoma angioinmunoblástico. Proporcionar una base para aplicar este método a otras enfermedades.
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Artículo de método
PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Cuando se monitorea la enfermedad residual mínima (ERM) después del tratamiento tumoral, hay requisitos más altos del límite inferior de detección que cuando se detectan mutaciones de resistencia a los medicamentos y mutaciones de células tumorales circulantes durante el tratamiento. La secuenciación tradicional de Sanger tiene un 5%-20% de detección de mutaciones de tipo salvaje, por lo que su límite de detección no puede cumplir con los requisitos correspondientes. Las tecnologías de bloqueo de tipo salvaje que se ha informado que superan esto incluyen la amplificación de desplazamiento de bloqueadores (BDA), el ácido nucleico bloqueado no extensible (LNA), las sondas específicas de puntos calientes (HSSP), etc. Estas tecnologías utilizan secuencias específicas de oligonucleótidos para bloquear el tipo salvaje o reconocer el tipo salvaje y luego combinarlo con otros métodos para evitar la amplificación del tipo salvaje y amplificar la amplificación de mutantes, lo que da lugar a características como alta sensibilidad, flexibilidad y comodidad. Este protocolo utiliza BDA, una PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación de Sanger, para optimizar la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia RHOA G17V, y la sensibilidad de detección puede alcanzar el 0,5%, lo que puede proporcionar una base para el seguimiento de la ERM del linfoma angioinmunoblástico de células T.
Introducción
La enfermedad residual mínima (ERM) es la pequeña cantidad de células cancerosas que aún están presentes en el cuerpo después del tratamiento. Debido a su pequeño número, no provocan ningún signo o síntoma físico. A menudo pasan desapercibidos por los métodos tradicionales, como la visualización microscópica y/o el seguimiento de proteínas séricas anormales en la sangre. Un resultado positivo de la prueba de ERM indica la presencia de células enfermas residuales. Un resultado negativo significa que las células enfermas residuales están ausentes. Después del tratamiento contra el cáncer, las células cancerosas res....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el comité de revisión de ética médica del Hospital Central de Yongzhou (número de aprobación: 2024022601). Los participantes dieron su consentimiento informado.
1. Diseño de imprimación
- Diseño de imprimación convencional: Diseñe los cebadores de acuerdo con las reglas de diseño de cebadores20 informadas, el diseño de cebadores por NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Para el sitio de mutación de RHOA G17V, todas las secuencias de referencia para el diseño de cebadores....
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Resultados
Compare la secuencia de la muestra de prueba con la secuencia de referencia para obtener el estado de mutación de la muestra de prueba. La tecnología WBT-PCR basada en BDA puede detectar la conocida mutación RHOA G17V y otras mutaciones de baja frecuencia en el intervalo de amplificación de los cebadores aguas arriba y aguas abajo. Véase la figura 1. Dos genes adicionales, a saber, IDH2 y JAK1, también se analizaron utilizando este método, Figura 2
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Discusión
La WTB-PCR basada en la tecnología BDA, descrita en este artículo, introduce un cebador no coincidente complementario al tipo mutante cuando se diseñan cebadores convencionales para competir con el tipo salvaje, suprimir el tipo salvaje y amplificar el producto mutante. A continuación, se secuenciaron los productos WTB-PCR para el análisis de mutaciones. La utilidad de WTB-PCR/Sanger es su simplicidad y alta sensibilidad. De acuerdo con el esquema de detección establecido en este trabajo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación se completó con el apoyo financiero de Kindstar Global Corporation y la ayuda de los líderes del Laboratorio de Biología Molecular y colegas relacionados. Gracias a la empresa, a los líderes y a los compañeros relevantes por su apoyo y ayuda. Este artículo solo se utiliza para investigación científica y no constituye ninguna actividad comercial.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Extractor automático de ADN | 9001301 | Qiagen | |
| Detector de ácidos nucleicos de ADN | Q32854 | Thermo fisher | |
| Kit de amplificación de PCR | P4600 | merck | |
| Instrumento de PCR | C1000 Touch | Biorad | |
| solución de proteinasa K | D3001-2-A tampón de | investigación | |
| D3001-2-C | zymo research | ||
| Kit de enzimas de amplificación de secuenciación | P7670-FIN | Qiagen |
Referencias
- Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019).
- Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cel....
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Reimpresiones y permisos
