מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית

סיכום

מאמר פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס RCAS(A) בעדשת עוף עוברית ככלי לחקר תפקוד באתרו וביטוי חלבונים במהלך התפתחות העדשה.

תקציר

עוף עוברי (Gallus domesticus) הוא מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה והפיזיולוגיה, בהתחשב במידת הדמיון הגבוהה שלה לעדשה האנושית. RCAS(A) הוא רטרו-וירוס עוף בעל יכולת שכפול המדביק תאים מתחלקים, המשמש ככלי רב עוצמה לחקר הביטוי באתרו ותפקודם של חלבונים מסוג בר וחלבונים מוטנטיים במהלך התפתחות העדשה על ידי מיקרו-הזרקה ללומן הריק של שלפוחית העדשה בשלבי התפתחות מוקדמים, ומגביל את פעולתו לתאי עדשה מתרבים סביב. בהשוואה לגישות אחרות, כגון מודלים טרנסגניים ותרביות ex vivo, השימוש ברטרו-וירוס עופות בעל יכולת שכפול RCAS(A) מספק מערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. באופן ספציפי, העברת גנים ממוקדת יכולה להיות מוגבלת לתאי סיבי עדשה מתרבים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות. במאמר זה, נסקור בקצרה את השלבים הדרושים להכנת רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A), נספק סקירה מפורטת ומקיפה של הליך המיקרו-הזרקה, ונספק תוצאות לדוגמה של הטכניקה.

מבוא

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של עדשת עוף עוברית של RCAS(A) (סרקומה של עופות / רטרו-וירוס לויקוזיס A). העברה רטרו-ויראלית יעילה בעדשת עוף עוברית הוכחה ככלי מבטיח לחקר in vivo של המנגנון המולקולרי והמבנה-תפקוד של חלבוני עדשה בפיזיולוגיה רגילה של העדשה, בתנאים פתולוגיים ובהתפתחות. יתר על כן, מודל ניסיוני זה יכול לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות וסינון תרופות למצבים כגון קטרקט מולד אנושי. בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לפרוס את הצעדים הדרושים לפיתוח פלטפורמה להתאמה אישית לחקר חלבוני עדשה.

אפרוחים עובריים (Gallus domesticus), בשל הדמיון שלהם במבנה העדשה ובתפקודה עם העדשה האנושית, הם מודל חייתי מבוסס היטב לחקר הת....

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו. לסקירה כללית של הפרוטוקול, ראו איור 1; עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

איור 1: מתווה ניסויי. 1 . הש....

תוצאות

לאחר קביעת חלבון מטרה ספציפי וזיהוי רצפי הגנים הקשורים, הגישה הניסויית הכוללת כוללת שיבוט של רצפי הגן לווקטור RCAS(A) רטרו-ויראלי על ידי השיבוט הראשוני לווקטור מתאם, ואחריו וקטור נגיפי. שנית, חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה מוכנים באמצעות תאי אריזה כדי לקצור ולרכז את הנגיפים. שני הצעדים העיקריים הראשונים תוארו במידה רבה והתוצאות המייצגות הוצגו במקומות אחרים 6,7,8,14,16.

דיון

מודל ניסיוני זה מציע הזדמנות לבטא את העניין של החלבונים בעדשה השלמה, מה שמוביל לחקר הרלוונטיות התפקודית של חלבונים אלה במבנה העדשה ובתפקודה. מודל המיקרו-הזרקה של אפרוח עוברי מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. ^al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. ^al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמידים נגיפיים וחומרים כגון אגוניסטים, RNA מפריע קטן (siRNA) ופפטידים לעדשת אפרוחים 1,9,10,11,12,13.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 ומיקרו; m מסנן	קורנינג	431118	להסרת פסולת סלולרית ממדיה
35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת תרבות	FisherScientific	50-202-030	לשימוש במהלך מיקרו-הזרקה
צנטריפוגה	פישרברנד	13-100-676	תמיסת סיבוב מבנה
	GENEWIZ-ליצירת
מבנים ניתוח מיקרוסקופ	AmScope	SM-4TZ-144A	הדמיה של עדשה לפריימרים PCR של DNA מיקרו-הזרקה
	טכנולוגיות DNA	משולבות-יצירת	פריימרים: לולאה תוך-תאית (IL) - Cx50 (שאריות 1– 97 ו-149– 400) כמו גם וקטור Cla12NCO התקבלו עם זוג הפריימרים הבאים: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; אנטיסנס, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs של Cx43 (שאריות 98– 150) ו-Cx46 (שאריות 98– 166) היו  מתקבל עם זוגות הפריימרים הבאים: sense, TACGTGATGAGGAAAGAG; אנטיסנס, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; חוש, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC ב-ACGGATTC, בהתאמה תבנית המבנה Cla12NCO-Cx43 התקבלה עם זוג הפריימרים הבאים: sense, CTGCTTCGTACTTACATC; אנטיסנס, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs של Cx50 (שאריות 98– 148) או Cx46 (שאריות 98– 166) שוכפלו על ידי שימוש במבנים Cla12NCO-Cx50 ו-Cla12NCO-Cx46 כתבניות עם זוג הפריימרים הבאים: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; אנטיסנס, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; חוש, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, בהתאמה
Drummond Nanoject II מזרק ננוליטר אוטומטי	Drummond Scientific	3-000-204	מיקרו-הזרקה פיפט
כפול צוואר אווז אורות מיקרוסקופ תאורה	AmScope	LED-50WY	תאורה להדמיה
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		לתרבית
תאים מחזיק ביצים	-		טבעות קלקר תוצרת בית בקוטר 2 אינץ' וגובה חצי אינץ'
חממת ביצים	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	לדגירה של ביצים מופרות
Fast Green	Fisher מדעי	F99-10	להדמיה של הזרקת מלאי ויראלי
ביצי עוף לבנים מופרים	טקסס A& M University	N/A	מודל בעלי חיים לבחירה עבור מיקרו-הזרקה (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
סרום בקר עוברי (FBS)	מעבדות		לתרבית תאים
מצומד פלואורסצאין נגד עכבר IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	לאנטי FLAG  1:500
מלקחיים	FisherScientific	22-327379	להזזת דברים בידוד
נימי זכוכית	Sutter Instruments	B100-75-10	מיקרופיפטה מזכוכית להזרקת מיקרו (OD 1.0 מ"מ, תעודת זהות 0.75 מ"מ, אורך 10 ס"מ)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	להעברה
חולץ מיקרופיפטה אנכי ידני	Sutter Instruments	P-30	להשגת מיקרופיפטה מזכוכית בגודל הנכון
צינורות מיקרוצנטריפוגה	FisherScientific	02-682-004	תמיסת המסה
מיקרוסקופ	Keyence	BZ-X710	להדמיה צביעת
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	הנחת תמיסה
פניצילין/סטרפטומיצין	Invitrogen		לתרבית תאים
Pico-Injector	מכשיר הרווארד	PLI-100	לאספקת נפחי נוזלים קטנים בדיוק דרך מיקרופיפטות על ידי הפעלת לחץ מווסת לפרק זמן מוגדר דיגיטלית
ארנב אנטי-אפרוח AQP0	נוצר		עצמי-ג'יאנג JX, לבן TW, גודאינף DA, פול DL. שיבוט מולקולרי ואפיון פונקציונלי של קונקסין סיבי עדשת אפרוח 45.6. תא מול ביול. מרץ 1994; 5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
ארנב נגד FLAG נוגדן	Rockland Immunichemicals	600-401-383	לצביעה FLAG
מצומד רודמין נגד ארנב IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	לאנטי-AQP0  1:500
כרית הידוק ספוג	Sutter Instruments	BX10	לאחסון מיקרופיפטה מזכוכית

Hyclone