Translationales 3D-Zellkulturmodell zur Bewertung von Hyperoxie-Effekten auf humane neonatale Atemwegsepithelzellen

Cynthia M. Carter; Maxwell M. Mathias; Lora Bailey-Downs; Trent E. Tipple; Peter F. Vitiello; Matthew S. Walters; Abhrajit Ganguly

doi:10.3791/65913

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Methodenartikel

Translationales 3D-Zellkulturmodell zur Bewertung von Hyperoxie-Effekten auf humane neonatale Atemwegsepithelzellen

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DOI:

10.3791/65913

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12. Juli 2024

Cynthia M. Carter¹ , Maxwell M. Mathias¹ , Lora Bailey-Downs¹ , Trent E. Tipple¹ , Peter F. Vitiello¹ , Matthew S. Walters² , Abhrajit Ganguly¹

¹Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, ²Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Etablierung eines Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen-Kulturmodells (ALI) unter Verwendung neonataler Tracheal-Atemwegsepithelzellen (nTAEC) und führen eine physiologisch relevante Hyperoxie-Exposition durch, um die Wirkung von atmosphärisch induziertem oxidativem Stress auf Zellen zu untersuchen, die aus dem sich entwickelnden neonatalen Atemwegsepithel stammen.

Zusammenfassung

Das Epithel der Atemwege bei Frühgeborenen ist ständig Umwelteinflüssen ausgesetzt. Einer dieser Stressoren bei Neugeborenen mit Lungenerkrankung ist die Sauerstoffspannung (O₂), die höher ist als die Umgebungsatmosphäre - die sogenannte Hyperoxie (>21 % O₂). Die Wirkung von Hyperoxie auf die Atemwege hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter das Entwicklungsstadium der Atemwege, der Grad der Hyperoxie und die Dauer der Exposition, wobei variable Expositionen möglicherweise zu einzigartigen Phänotypen führen. Während es umfangreiche Forschungen über die Auswirkungen von Hyperoxie auf die Lungenalveolarisierung und die Hyperreaktivität der Atemwege bei Neugeborenen gibt, ist wenig über die kurz- und langfristige Wirkung von Hyperoxie auf menschliche neonatale Atemwegsepithelzellen bekannt. Ein Hauptgrund dafür ist der Mangel an einem effektiven In-vitro-Modell zur Untersuchung der Entwicklung und Funktion des Epithels der Atemwege bei menschlichen Neugeborenen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Expansion humaner neonataler Tracheal-Atemwegsepithelzellen (nTAECs) unter Verwendung von humanen neonatalen Trachealaspiraten und zur Kultivierung dieser Zellen in einer Luft-Flüssig-Grenzfläche (ALI)-Kultur. Wir zeigen, dass nTAECs in ALI-Kulturen eine reife polarisierte Zell-Monoschicht bilden und eine mukoziliäre Differenzierung durchlaufen. Wir stellen auch eine Methode zur moderaten Hyperoxie-Exposition der Zellmonoschicht in ALI-Kultur unter Verwendung eines speziellen Inkubators vor. Darüber hinaus beschreiben wir einen Assay zur Messung von zellulärem oxidativem Stress nach Hyperoxie-Exposition in ALI-Kulturen mittels Fluoreszenzquantifizierung, der bestätigt, dass eine moderate Hyperoxie-Exposition zellulären oxidativen Stress induziert, aber keine signifikante Zellmembranschädigung oder Apoptose verursacht. Dieses Modell kann möglicherweise verwendet werden, um eine klinisch relevante Hyperoxie-Exposition zu simulieren, der neonatale Atemwege auf der Neugeborenen-Intensivstation (NICU) ausgesetzt sind, und um die kurz- und lang anhaltenden Auswirkungen von O₂ auf die Epithelprogrammierung der Atemwege bei Neugeborenen zu untersuchen. Studien, die dieses Modell verwenden, könnten genutzt werden, um Wege zu erforschen, wie oxidative Schädigungen der sich entwickelnden Atemwege im frühen Leben gemildert werden können, die an der Entwicklung langfristiger Atemwegserkrankungen bei ehemaligen Frühgeborenen beteiligt sind.

Einleitung

Therapeutischer Sauerstoff (O₂) ist eine der am häufigsten verwendeten Therapien auf der Neugeborenen-Intensivstation1. Folglich ist die Hyperoxie-Exposition (>21 % O₂) ein häufiger atmosphärischer Stressfaktor, dem Neugeborene mit und ohne signifikante Lungenerkrankung ausgesetzt sind. Die Reaktionen der Lunge auf Hyperoxie können je nach Intensität und/oder Dauer der Exposition und der anatomischen Lokalisation, dem Zelltyp und dem Stadium der Lungenentwicklung variieren 2,3,4,5,6.