Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.
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Artigo de método
Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um grande desafio na compreensão das causas da infertilidade feminina é elucidar os mecanismos que regem o desenvolvimento das células germinativas femininas, denominadas ovócitos. Seu desenvolvimento é marcado pelo crescimento celular e subsequentes divisões, duas fases críticas que preparam o ovócito para a fusão com os espermatozoides para iniciar a embriogênese. Durante o crescimento, os ovócitos reorganizam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, um evento preditivo do sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos e, portanto, de seu potencial embriogênico. Em ovócitos de camundongos, essa reorganização citoplasmática mostrou-se impulsionada pelo citoesqueleto, cuja atividade gera forças mecânicas que agitam, reposicionam e penetram no núcleo. Consequentemente, essa transmissão de força citoplasmática para nucleoplasmática sintoniza a dinâmica de organelas de processamento de RNA nuclear conhecidas como condensados biomoleculares. Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar, com alta resolução temporal, o impacto do citoesqueleto no núcleo através de escalas espaciais em ovócitos de camundongos. Detalha as etapas e ferramentas de análise de imagem e imagem necessárias para avaliar i) atividade citoesquelética no citoplasma do oócito, ii) agitação do núcleo do oócito baseada no citoesqueleto e iii) seus efeitos na dinâmica do condensado biomolecular no nucleoplasma do oócito. Além da biologia oocitária, os métodos aqui elaborados podem ser adaptados para uso em células somáticas para abordar similarmente a sintonia baseada no citoesqueleto da dinâmica nuclear em escalas.
Introdução
O posicionamento nuclear é essencial para múltiplas funções celulares e de desenvolvimento 1,2,3,4,5. As células germinativas femininas de mamíferos denominadas ovócitos remodelam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, apesar de sofrerem uma divisão assimétrica no tamanho, que depende da descentralização cromossômica6 (Figura 1). Essa centralização do núcleo prediz o sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia e aprovados pelo Ministério da Agricultura francês (autorização nº 75-1170) e pela Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; Acordo OGM número DUO-5291). Os camundongos foram alojados no biotério em um ciclo claro/escuro de 12 horas, com temperatura ambiente de 22-24 °C e umidade de 40%-50%. Os camundongos usados aqui incluem fêmeas OF1 (Oncins France 1, 8 a 12 semanas de idade) e fêmeas C57BL/6 (10 a 14 semanas de idade).
1. Coleta e preparo de ovócitos
- Coletar ovócitos de camundongos de 8 a 14....
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Resultados
Os painéis de imagem na Figura 3 mostram exemplos de um ovócito típico totalmente crescido (Figura 3A), o nucleoplasma em um ovócito totalmente crescido expressando YFP-Rango (Figura 3B), o nucleoplasma em um ovócito totalmente crescido expressando um correto (painel esquerdo; Figura 3C) ou um excessivo (painel direito; Figura 3C) dose de cRNA SRSF2-GFP e imunomarcação de m.......
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Discussão
As principais etapas desse protocolo incluem a microinjeção adequada de ovócitos sem afetar sua sobrevivência ou função normal 9,10,11, bem como a microinjeção de quantidades pré-definidas de cRNA que permitiriam a visualização correta de estruturas relevantes, como manchas nucleares.
Estabelecer a ligação entre a dinâmica citoplasmática e a dinâmica (intra)-nuclear é essencial quando se estuda como o.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
A.A.J. e M.A. co-escreveram o manuscrito e todos os coautores comentaram sobre o manuscrito. M. A. é apoiado pelo CNRS e "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. é apoiado pela Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel e Fondation du Collège de France.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Sigma | A3311 | |
| CSU-X1-M1 | Yokogawa | ||
| DMI6000B microscópio | Leica | ||
| Femtojet | Eppendorf | ||
| Fiji | |||
| Roda de filtro | Sutter Instruments Software Metamorph | ||
| Fluorodish | World Precision Instruments | ||
| Imagem Universal, | versão 7.7.9.0 | ||
| Óleo mineral | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
| NanoDrop 2000 | Camundongos Thermo Scientific | ||
| OF1 e C57BL/6 | da Charles River Laboratories | ||
| Thermo Fisher | AM1350 | ||
| Retiga 3 | Kit QImaging | ||
| RNAeasy | Qiagen | 74104 | |
| SC35 anticorpo | Abcam | ab11826 | Anticorpo de mancha nuclear; camundongo IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400) |
| SRSF2-GFP plasmídeo | OriGene Technologies | MG202528 | NM_011358 |
| Micropipeta Stripper | XLAB Solutions | especializada para coleta de oócitos | |
| T3 mMessage mMachine | Thermo Fisher | AM1384 | |
| T7 mMessage mMachine | Thermo Fisher | AM13344 | |
| Serviço de | |||
| Windows Excel | Windows |
Referências
- Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
- Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).
- Gundersen, G. G., Worman....
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Reimpressões e permissões
