本文介绍一种简单的方法，用于直接观察和自动测量细菌侵染下拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔的响应。该方法利用一种便携式气孔成像设备，并结合专为该设备所拍摄叶片图像设计的图像分析流程。
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方法文章
气孔响应的直接观察与自动测量 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000 在 拟南芥
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
气孔是存在于植物叶片表皮中的微小孔隙。气孔开度的调控不仅对平衡光合作用所需的二氧化碳吸收与蒸腾作用导致的水分流失至关重要，同时也可限制细菌侵入。当植物识别到微生物时会关闭气孔，但某些致病性细菌（如丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，简称 Pto））能够重新打开已关闭的气孔，从而进入叶片内部。在传统的评估气孔对细菌侵袭反应的实验中，通常将叶片表皮剥离物、叶圆片或离体叶片漂浮于细菌悬浮液中，随后在显微镜下观察气孔，并手动测量气孔开度。然而，这些方法操作繁琐，且可能无法真实反映植物在自然状态下叶片仍附着于植株时的气孔响应。最近，研究人员开发出一种便携式成像设备，可在不摘除叶片的情况下通过夹持叶片直接观察气孔，同时配套开发了基于深度学习的图像分析流程，可自动从设备拍摄的叶片图像中测量气孔开度。在此基础上，本文介绍了一种评估拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔对细菌侵袭响应的新方法。该方法包括三个简单步骤：模拟自然感染过程的Pto喷雾接种、利用便携式成像设备直接观察接种Pto后植株叶片上的气孔，以及通过图像分析流程自动测量气孔开度。该方法已成功用于展示在接近自然植物-细菌相互作用条件下，Pto侵入过程中气孔的关闭与重新开放现象。
引言
气孔是位于植物叶片及其他地上部分表面、由一对保卫细胞包围的微小孔隙。在不断变化的环境中，气孔开度的调控对植物至关重要，使其能够在通过蒸腾作用损失水分的同时，控制光合作用所需的二氧化碳吸收。因此，气孔开度的量化对于理解植物环境适应机制具有重要意义。然而，气孔开度的量化本质上费时且繁琐，需要人工在显微镜拍摄的叶片图像中识别并测量气孔孔隙。为克服这些局限，已开发出多种方法以促进气孔开度的量化 拟南芥 广泛用于研究气孔生物学的模式植物1,2,3,4,5,6例如，可以使用气孔计测量蒸腾速率，以此作为气孔导度的指标。然而，该方法无法直接提供决定气孔导度的气孔数量和孔径信息。一些研究采用共聚焦显微镜技术，利用荧光肌动蛋白标记物、荧光染料或细胞壁自发荧光来显示气孔孔隙1,2,3,4
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方案
1. 植物培养
- 为打破休眠，将 A. thaliana (Col-0) 种子重悬于去离子水中，并在黑暗条件下于 4 °C 下孵育 4 天。
- 将种子播种于土壤中，并在配备白色荧光灯的培养室中生长。维持以下生长条件：温度 22 °C，光照强度 6,000 lux（约 100 µmol/m2/s），光照时间 10 小时，相对湿度 60%。
- 必要时，用液体肥料浇灌植株。在接种前 1 周至前 2 天期间避免浇水，并在接种前 1 天充分浇水。
2. 准备细菌接种物
- 从甘油菌种中挑取Pto，在含50 µg/mL利福平的固体King's B（KB）培养基（每升含20 g胰蛋白胨、1.5 g K2HPO4、15 g甘油，1.5%琼脂）上划线，于28 °C培养2天。
- 挑取单菌落接种至5 mL含50 µg/mL利福平的KB液体培养基中，于28 °C、200 rpm振荡培养至对数生长后期。
- 将菌液在6,000 x g离心2分钟，弃上清，菌体沉淀用1 mL无菌水重悬。重复此步骤一次。
- 弃去上清，将菌体沉淀用1 mL气孔开放缓冲液（25 mM MES-KOH ....
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结果
在对Pto进行喷雾接种后，使用便携式气孔成像装置直接观察接种植株叶片上的气孔。通过手动和自动测量方法，利用相同的叶片图像，计算约60个气孔的宽度与长度比值，以确定气孔开度。手动和自动测量结果均一致显示，在接种后1小时（hpi），Pto接种植株的气孔开度较对照接种植株显著降低（图3A、B），表明A. thaliana植株在Pto侵染后会关闭气孔。在接种后3小时，Pto接种植株与对照接种植株的气孔开度基本相同（图3C、D），提示气孔重新开放，类似于Pto诱导的气孔再开放现象。值得注意的是，自动测量气孔开度处理单张图像仅需约5秒（Table 1），与手动测量相比，测量时间减少了95%以上。因此，本方案提供了一种操作简便且节省人力的方法，用于追踪A. thaliana对细菌病原体的动态气孔响应。
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讨论
既往研究采用表皮条、叶盘或离体叶片来探究气孔对细菌侵染的响应9,11,12。相比之下，本研究提出的方法利用便携式气孔成像装置，在喷雾接种Pto后直接观察仍附着于植株上的叶片气孔，从而模拟细菌侵染的自然条件。此外，由于该方法无需进行叶片摘除、叶盘切割或表皮剥离等具有破坏性的样品制备步骤，因此可避免由此类操作引起的机械损伤和水分流失。这些影响不容忽视，因为机械损伤和水分流失不可避免地会引发植物源性信号分子（如植物激素茉莉酸和脱落酸）的产生，进而影响气孔运动13,14。
便携式气孔成像设备的最佳使用需遵循若干指导原则。首先，必须彻底清除叶片表面的水滴，以获得清晰度和聚焦效果最佳的图像。其次，建议通过调节调焦螺丝对同一叶片区域拍摄多张图像，以精细调整焦距。该操作有助于增加.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢研究项目“通过植物-微生物全生物体组装共同创造植物适应性状”的所有成员进行的富有成果的讨论。本工作得到了变革性研究领域资助（A.M. 获资助号 21H05151 和 21H05149，Y.T. 获资助号 21H05152）以及挑战性探索研究资助（A.M. 获资助号 22K19178）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| 喷枪套件 | ANEST IWATA | MX2900 | SPRINT JET 配套附件套件 |
| 植物培养箱（Biotron） | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | 配备白色荧光灯的植物生长培养箱 |
| 甘油 | Wako | 072-00626 | |
| 半尺寸育苗盘 | Sakata | 72000113 | 包含托盘和盖子的套装 |
| Hyponex | Hyponex | 无目录编号 | 将 Hyponex 溶液用去离子水按 1:2000 比例稀释后用于浇灌植物 |
| Image J | National Institute of Health | 下载地址 https://imagej.nih.gov/ij/download.html | 用于人工测量气孔开度 |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | 用于配制 MES-KOH 缓冲液 |
| MES | Wako | 343-01621 | 用于配制 MES-KOH 缓冲液 |
| 便携式气孔成像装置 | Phytometrics | 订购网址 https://www.phytometrics.jp/ | Takagi 等 (2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018 |
| 利福平 | Wako | 185-01003 | 溶于 DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | 喷雾接种中使用的有机硅表面活性剂 |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | 用于喷雾接种的喷枪 |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | 与 Vermiculite G20 等比例混合以配制培养土 |
| 胰蛋白胨 | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| 蛭石 G20 | Nittai | 无目录编号 | 与 SuperMix A 等比例混合以配制培养土 |
| 白色荧光灯 | NEC | FHF32EX-N-HX-S | 用于 Biotron 植物培养箱 |
参考文献
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al.
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重印与许可
