Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish
Summary
Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.
Abstract
Gli studi in vivo sul comportamento dei tumori sono un punto fermo della ricerca sul cancro; Tuttavia, l’uso dei topi presenta sfide significative in termini di costi e tempo. Qui, presentiamo il pesce zebra larvale come un modello di trapianto che presenta numerosi vantaggi rispetto ai modelli murini, tra cui facilità di manipolazione, bassa spesa e breve durata sperimentale. Inoltre, l’assenza di un sistema immunitario adattativo durante gli stadi larvali ovvia alla necessità di generare e utilizzare ceppi immunodeficienti. Sebbene esistano protocolli consolidati per lo xenotrapianto in embrioni di zebrafish, presentiamo qui un metodo migliorato che coinvolge la stadiazione degli embrioni per un trasferimento più rapido, l’analisi della sopravvivenza e l’uso della citometria a flusso per valutare il carico della malattia. Gli embrioni vengono messi in scena per facilitare l’iniezione rapida di cellule nel tuorlo delle larve e la marcatura delle cellule per monitorare la consistenza del bolo cellulare iniettato. Dopo l’iniezione, l’analisi della sopravvivenza dell’embrione viene valutata fino a 7 giorni dopo l’iniezione (dpi). Infine, il carico di malattia viene valutato anche marcando le cellule trasferite con una proteina fluorescente e analizzando mediante citometria a flusso. La citometria a flusso è resa possibile da un metodo standardizzato di preparazione di sospensioni cellulari da embrioni di zebrafish, che potrebbe essere utilizzato anche per stabilire la coltura primaria di cellule di zebrafish. In sintesi, la procedura qui descritta consente una valutazione più rapida del comportamento delle cellule tumorali in vivo con un numero maggiore di animali per braccio di studio e in modo più economico.
Introduction
L’analisi del comportamento dei tumori in risposta ad alterazioni genetiche o al trattamento farmacologico in vivo è un elemento essenziale della ricerca sul cancro 1,2,3,4. Tali studi comportano il più delle volte l’uso di modelli murini immunocompromessi (Mus musculus)5; Tuttavia, gli studi sugli xenotrapianti nei topi sono limitati sotto molti aspetti, tra cui capacità limitata, durata prolungata, spese significative e la necessità di sofisticate apparecchiature di imaging per monitorare la progressione dei tumori interni 6,7. Al contrario, il modello del pesce zebra (Danio rerio) consente una maggiore capacità, una durata più breve, una spesa inferiore e, grazie alla loro trasparenza, un semplice monitoraggio della progressione della malattia 8,9.
Il pesce zebra è un sistema modello di vertebrato ben sviluppato con sviluppo ex-utero e alta fecondità, con singole femmine che producono più di 100 embrioni10. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono una facile visualizzazione dei processi di sviluppo utilizzando tecniche legate alla fluorescenza come i reporter. Infine, la conservazione dei processi critici di sviluppo li rende un modello ideale per molti tipi di studi, incluso il comportamento delle cellule maligne trapiantate11,12. Gli embrioni di zebrafish wild-type sviluppano melanociti, che li rendono otticamente opachi entro le 2 settimane di età, ma questo è stato superato dalla generazione di embrioni di casper (roya9; mitfaw2), che rimangono trasparenti per tutta la vita13. A causa delle loro proprietà ottiche, i pesci zebra casper sono riceventi ideali di cellule tumorali trapiantate 14,15,16. Lo xenotrapianto di cellule tumorali in zebrafish ha acquisito importanza negli ultimi 2 decenni 17,18,19,20,21. Gli embrioni di pesce zebra hanno un’immunità innata; Tuttavia, mancano di immunità adattativa durante il loro stadio larvale, rendendoli immunocompromessi dal punto di vista funzionale, il che consente loro di fungere da ospiti efficaci per gli xenotrapianti tumorali trapiantati22.
Sono stati sviluppati protocolli per l’attecchimento tumorale in embrioni di zebrafish e adulti che hanno considerato una serie di variabili diverse 23,24,25,26,27. Questi hanno esplorato numerosi siti di deposizione tumorale nel pesce zebra, comprese le iniezioni nel tuorlo, nello spazio peri-vitellino e nel cuore e in diversi stadi di sviluppo16,28. Anche la temperatura ambiente dell’acquacoltura per gli xenotrapianti di pesce zebra è importante poiché l’allevamento del pesce zebra avviene in genere a 28 °C, mentre le cellule dei mammiferi crescono a 37 °C. Di conseguenza, deve essere impiegata una temperatura di compromesso che sia tollerata dai pesci ma che supporti la crescita del tumore, e 34 °C sembra raggiungere entrambi gli obiettivi29. L’analisi del comportamento e della progressione dei tumori a seguito di xenotrapianto è un’altra importante area di interesse, e ciò comporta l’uso di una varietà di modalità di imaging e l’analisi della sopravvivenza30. Uno dei principali vantaggi del modello zebrafish è la disponibilità di un gran numero di animali in studio per fornire un’immensa potenza statistica agli studi in vivo del comportamento tumorale; Tuttavia, gli approcci precedenti hanno fortemente limitato questo potenziale a causa della necessità di noiose procedure di montaggio per le iniezioni.
Qui, affrontiamo questa limitazione attraverso lo sviluppo di un metodo semplice e rapido con cui mettere in scena gli embrioni che consente un’elevata produttività e il monitoraggio della qualità dell’iniezione utilizzando la linea trasparente casper zebrafish. Ciò comporta l’iniezione di xenotrapianti nel sacco vitellino degli embrioni di pesce zebra casper a 2 giorni dalla fecondazione (dpf). Osserviamo la sopravvivenza degli embrioni dopo lo xenotrapianto come parte dell’analisi del comportamento tumorale. Mostriamo inoltre la valutazione del carico di malattia dopo xenotrapianto effettuando sospensioni di singole cellule e analizzando mediante citometria a flusso (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo xenotrapianto di pesce zebra è emerso come un’alternativa rapida, robusta ed economica agli studi sui topi12. Sebbene siano stati riportati diversi approcci allo xenotrapianto di pesce zebra, il nostro adattamento ha portato a miglioramenti significativi. Oltre a standardizzare i parametri relativi alla procedura, questi miglioramenti si concentrano specificamente sull’accelerazione della velocità con cui possono essere eseguite le iniezioni tumorali, consentendo così un aumento del numero d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R37AI110985 e P30CA006927, uno stanziamento del Commonwealth della Pennsylvania, della Leukemia and Lymphoma Society e del Bishop Fund. Questo studio è stato supportato anche dalle strutture principali di Fox Chase, tra cui la coltura cellulare, la citometria a flusso e la struttura per animali da laboratorio. Ringraziamo la dottoressa Jennifer Rhodes per aver mantenuto la struttura di zebrafish e microiniezione presso FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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