Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

Yuna Satake; Nozomi Gotouda; Seiji Tanaka

doi:10.3791/66423

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Artículo de método

Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

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DOI:

10.3791/66423

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29 de diciembre de 2023

Yuna Satake¹ , Nozomi Gotouda¹ , Seiji Tanaka¹^,²

¹Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, ²School of Engineering Science, Kochi University of Technology

En este artículo

Resumen

Las interacciones de las biomoléculas, como las interacciones proteína-proteína, son la base molecular de las funciones biológicas. Si se pueden aislar mutantes nulos/deteriorados por interacción que carecen específicamente de la interacción relevante, serán de gran ayuda para comprender las funciones de esta interacción. Este artículo presenta una forma eficiente de aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína son uno de los procesos más básicos que subyacen a los fenómenos biológicos. Una de las formas más sencillas y mejores de comprender el papel y la función de una interacción proteína-proteína específica es comparar el fenotipo del tipo salvaje (con la interacción proteína-proteína relevante) y los de los mutantes que carecen de la interacción relevante. Por lo tanto, si estos mutantes se pueden aislar, ayudarán a dilucidar los procesos biológicos relacionados. El procedimiento de dos híbridos de levadura (Y2H) es un enfoque poderoso no solo para detectar interacciones proteína-proteína, sino también para aislar mutantes nulos o deteriorados de interacción. En este artículo, se presenta un protocolo para aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción utilizando la tecnología Y2H. En primer lugar, se construye una biblioteca de mutaciones combinando la reacción en cadena de la polimerasa y una eficiente tecnología de clonación sin fisuras, que excluye eficazmente el vector vacío de la biblioteca. En segundo lugar, los mutantes nulos o deteriorados por interacción se examinan mediante el ensayo Y2H. Debido a un truco en el vector Y2H, los mutantes no deseados, como aquellos con cambio de marco y mutaciones sin sentido, se eliminan de manera eficiente del proceso de detección. Esta estrategia es simple y, por lo tanto, se puede aplicar a cualquier combinación de proteínas cuya interacción pueda ser detectada por el sistema de dos híbridos.

Introducción

Las interacciones entre biomoléculas son la parte más básica de los fenómenos biológicos. Las interacciones proteína-proteína constituyen una parte importante de dichas interacciones. Por lo tanto, la identificación de los socios de interacción de una proteína de interés es fundamental para dilucidar aún más la función de la proteína/gen de interés. El método de dos híbridos de levadura (Y2H) es una técnica popular para identificar interacciones proteína-proteína in vivo¹. En este sistema, dos proteínas (X e Y) cuya interacción se va a probar se fusionan con el dominio de unión al ADN (DB) y el dominio de activación transcripcional (AD....