本文介绍了一种利用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体成像的实验方案。该方法为实时研究小鼠肺移植后细胞动态变化及细胞间相互作用提供了有力工具。
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本文内容
摘要
摘要
肺移植术后并发症在很大程度上与宿主免疫系统对移植物的反应有关。此类免疫反应由供体与受体细胞之间的相互作用所调控。深入理解这些过程依赖于临床前动物模型的应用，并得益于实时观察移植物内免疫细胞迁移的能力。活体双光子显微镜可用于对组织和器官进行成像，成像深度可达数百微米，且光损伤极小，相比单光子共聚焦显微镜具有显著优势。在活体双光子显微成像过程中，选择性地使用启动子特异性表达荧光蛋白的转基因小鼠，和/或过继转移荧光染料标记的细胞，可实现对生理环境下单个细胞动态行为的研究。我们课题组已建立一种稳定小鼠肺组织的技术，使我们能够在未受刺激的肺组织及原位移植的肺移植物中进行细胞动态成像。该技术可详细评估血管系统和间质内细胞的行为，并可用于研究不同细胞群体之间的相互作用。该方法易于掌握，可广泛应用于研究调控肺移植后炎症反应与耐受性反应的免疫机制，也可进一步拓展至其他肺部疾病病理过程的研究。
引言
肺移植是许多终末期肺部疾病患者的最终治疗选择；然而，与其他实体器官移植相比，肺移植后的长期生存率较差。移植后5年的生存率仅为约60%-70%1，而心脏移植为80%-90%2，肾移植为85%-90%3。肺移植后的多种并发症，例如原发性移植物功能障碍、抗体介导的排斥反应以及慢性肺移植物功能障碍，均源于宿主对同种异体移植物的免疫反应。例如，我们的研究团队已证实，在移植引起的缺血-再灌注损伤后，中性粒细胞会迅速被招募至肺移植物内，并在血液单核细胞周围形成动态簇集结构4。供体与受体细胞之间的相互作用导致有害的同种免疫反应5,6,7，而能够在活体动物模型中研究这些动态细胞相互作用具有重要价值。
双光子显微镜能够在组织光漂白最小化的情况下，实现高达数百微米深度的高分辨率活体成像8,9。该技术已广泛应用于多种组织和解剖部位，包括新皮层10,
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方案
所有动物操作程序均遵循美国国立卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》，并经华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。
1. 麻醉与插管
注意：正位小鼠左肺移植操作如前所述20,21。将20-25 g的C57BL/6（B6）小鼠的肺移植至性别和年龄相匹配的B6受体小鼠。在部分实验中，使用B6.LysM-GFP报告基因小鼠作为受体，以可视化中性粒细胞向肺移植物的浸润。受体小鼠在肺移植后可立即进行成像观察。
- 通过腹腔注射氯胺酮（80−100 mg/kg）和赛拉嗪（8−10 mg/kg）使小鼠重新麻醉。皮下注射缓释丁丙诺啡（0.5-1.0 mg/kg）以进一步控制疼痛。通过足垫夹捏试验确认麻醉深度。
注意：如果肺移植与计划的活体成像之间的时间间隔少于两小时，可给予初始剂量50%的氯胺酮追加麻醉。 - 使用电动剪刀去除整个左侧胸部的毛发，并擦拭胸部以清除剪下的多余毛发。
- 将不含药物的眼科软膏涂抹于小鼠眼睛，以防角膜干燥。
- 如前所述21，使用20 G套管针经口进行气管插管。
- 以每分钟120次呼吸频率、0.5 cc潮气量的....
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结果
在4 ˚C下冷缺血保存1小时后，我们将B6小鼠的左肺原位移植到B6.LysM-GFP小鼠体内4，随后按照上述方法进行活体双光子成像。我们在移植后两个时间点进行了成像：2小时（图3A）和24小时（图3B）。血管通过成像前立即注射的量子点标记为红色。此外，我们可以在24小时时间点观察到摄取量子点的单核细胞4。在移植后24小时的相应视频中，可见绿色标记的受体来源中性粒细胞浸润肺移植物（补充视频1）。由于胶原蛋白的二次谐波信号，肺泡呈现为暗色的火山口状结构（图3中的白色箭头所示）。我们观察到，与移植后2小时相比，移植后24小时肺组织中的中性粒细胞数量更多（图3）。
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讨论
双光子激发最早由玛丽亚·格佩特-梅耶（Maria Göppert-Mayer）于1931年在其博士论文中描述，她后来因提出原子核壳层结构而获得诺贝尔物理学奖22,23。传统的荧光显微技术依赖于单光子激发，其激发光波长较短、能量高于发射光波长。与单光子显微技术不同，双光子显微技术涉及两个光子同时激发，每个光子的波长均长于所发射荧光信号的波长24,25,26。由于需要两个独立的光子共定位以激发组织中的单一焦点，双光子激发在空间上局限于微小的样品体积，从而实现光学切片24,25,26，并且在焦点所在平面的上方和下方光漂白效应更弱
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披露
作者声明无相关利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）1P01AI11650 项目基金和巴恩斯-犹太医院基金会资助。我们感谢华盛顿大学医学院体内成像核心设施的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.75% 聚维酮碘 | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | 用作消毒剂 |
| 1英寸 20G 静脉导管 | Terumo | SROX2025CA | 用于气管插管（ETT） |
| 1英寸丝质胶带 | Durapore | 3M ID 7100057168 | 用于固定小鼠位置 |
| 20倍水浸长工作距离物镜 | Olympus | N20X-PFH | |
| 3M Vetbond 胶水 | Medi-Vet.com | 10872 | 用于将盖玻片粘附至肺组织 |
| 655 nm 非靶向量子点 | ThermoFisher | Q21021MP | 用于血管标记 |
| 70% 乙醇 | Sigma Aldrich | EX0281 | 用作消毒剂 |
| Argent 高温精细尖 cautery 笔 | McKesson | 231 | |
| 黑色 O 形圈（2 cm） | 五金商店 | N/A | 用于自制成像腔室 |
| 螺栓（2 个） | 五金商店 | N/A | 用于自制成像腔室 |
| 黄铜手拧螺母（2 个） | 五金商店 | N/A | 用于自制成像腔室 |
| 丁丙诺啡 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | 用于镇痛 |
| Chameleon 钛宝石飞秒脉冲激光器 | Coherent | N/A | |
| 盖玻片（24 mm × 50 mm） | Thomas Scientific | 1202F63 | 用于自制成像腔室 |
| 弯蚊式钳（1 把） | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 双通道加热控制器 | Warner Instruments | TC-344B | |
| 精细剪刀（1 把） | Fine Science Tools | 15040-11 | |
| 固定式直立显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| 纱布（裁剪为 1 cm × 3 cm） | McKesson | 476709 | 置于左肺下方 |
| 高真空润滑脂 | Dow Corning | N/A | 用于将盖玻片粘附至顶板 |
| 1% 异氟烷 | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | 用于麻醉 |
| 盐酸氯胺酮 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | 用于麻醉 |
| 金属片（3 cm × 7 cm） | 五金商店 | N/A | 用于自制成像腔室 |
| 尖头棉签 | Solon | 56225 | 用于操作肺组织及钝性分离 |
| Power Pro Ultra 电推剪 | Oster | 078400-020-001 | |
| Puralube Vet 眼用软膏 | Medi-Vet.com | 11897 | 用于防止眼睛干燥 |
| 小型动物呼吸机 | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
| 直型镊子（1 把） | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| 三通道快门驱动器 | Uniblitz | VMM-D3 | 共振扫描器 |
| x.y.z 光学步进电机 | Prior Scientific | OptiScan II | |
| 赛拉嗪 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | 用于镇痛 |
参考文献
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Khush, K. K.,
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重印与许可
