孕期大鼠游泳训练方案及护理方法

摘要

本文介绍了一种明确的大鼠繁殖方法、游泳训练程序以及训练后对妊娠大鼠的产后护理方案。该方案为研究妊娠期间母体运动对子代的影响及其潜在机制提供了动物模型。

摘要

健康与疾病发育起源理论强调了早期环境对糖尿病、心血管疾病和癌症等慢性非传染性疾病的影响。利用动物模型的研究已探讨了母体营养不良、营养过剩、肥胖以及接触化学物质或缺氧等因素如何影响胎儿发育和子代健康，导致低出生体重、高血压、血脂异常和胰岛素抵抗等问题。鉴于育龄女性中超重和肥胖的 prevalence 不断上升，有效的干预措施至关重要。妊娠期间的母体运动已成为一种关键干预手段，不仅有益于母亲，也有利于子代，降低疾病风险。本研究比较了三种妊娠大鼠运动模型的差异：自主转轮跑动、电动跑台和游泳。其中游泳因其安全且可控的运动强度而成为最有益的选择。本方案详细描述了大鼠繁殖方法、妊娠期间游泳训练以及产后护理流程。该模型适用于多种大鼠和小鼠品系，可用于研究母体运动对子代健康及代际健康的益处。

引言

健康与疾病发育起源（Developmental Origins of Health and Disease, DOHaD）概念在过去二十年中逐渐形成，表明生命早期发育阶段的环境影响会改变个体日后发生慢性非传染性疾病（NCD）相关病理生理过程的风险，尤其是糖尿病、心血管疾病以及某些类型的癌症¹。在胎儿发育可塑性最强的阶段，子代暴露于宫内环境之中，基因与环境的相互作用以及子宫胎盘灌注是胎儿程序化重编程的关键因素²。以往的研究主要利用动物模型探讨妊娠期间母体营养不足、营养过剩或肥胖，以及产前接触化学物质或缺氧等不利因素对胎儿发育及子代长期表型的影响³。这些因素可导致低出生体重及后续生长异常，并对子代产生不良影响，包括血压升高、脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗⁴。由于育龄女性中超重和肥胖的发生率正在迅速上升，迫切需要建立有效的干预措施，以防止这些有害母体状况的代际传递，这对人群健康具有重要意义^5,6。

运动长期以来一直被视为预防和治疗2型糖尿病、高血压以及多种其他疾病的重要手段⁷。孕期运动不仅对孕妇具有益处，还能对子代产生积极影响，从而减少疾病从母亲向子代的传递⁸。多年的研究已证实运动的安全性及其显著益处，包括显著降低妊娠期常见疾病如妊娠期糖尿病的发生率^9,10。然而，在保障母婴安全的前提下，实施运动训练以及产后哺乳期干预方案仍面临挑战。

David¹¹ et al. 描述了适用于心血管健康研究的动物运动模型。三种常用的运动模型——自主转轮跑、电动跑台和游泳——各有优缺点。自主转轮跑能较好地模拟大鼠的自然运动行为，使其能够按照自身的昼夜节律进行活动。然而，这种运动方式对强度和持续时间的精确调控较为困难。电动跑台可以控制运动的强度、运动量和持续时间，但有时需要使用电刺激，可能引发动物的生理和心理应激反应。由于大鼠具有天然的游泳能力，游泳在啮齿类动物研究中被广泛采用，同时还能避免电刺激或对足部及尾部造成的机械性损伤¹²。在产前运动模型的研究中^13,14，游泳是一种常用的运动方式。随着妊娠进展，大鼠腹部逐渐膨大，跑台和转轮跑运动可能导致腹部反复接触坚硬表面。相比之下，游泳所处的水环境具有浮力作用，可降低妊娠动物发生运动相关损伤的风险。

本方案介绍了大鼠的繁殖方法、妊娠期间进行游泳训练的操作步骤，以及训练后对妊娠大鼠的产后护理规程。这种妊娠期游泳训练模型可应用于多种大鼠和小鼠品系，因此可为未来利用动物模型开展的研究提供一种有价值的啮齿类模型，用于探讨母体运动对子代健康有益作用的调控机制，以及跨代运动益处的相关机制。

方案

本文所述所有方法均经北京体育大学动物伦理委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）指南、中国动物保护法律法规及机构相关规定执行。

1. 大鼠的交配与饲养

1. 购买10周龄SPF级Wistar雌性大鼠和11周龄SPF级Wistar雄性大鼠。
2. 实施适应性喂养：喂养Wistar大鼠 随意摄取 使用标准啮齿类动物饲料喂养，并在指定饲养设施中提供自来水，适应一周时间。确保所有大鼠饲养在12小时光照-黑暗循环条件下，温度恒定为22 °C，相对湿度为45-55%。
3. 检查雌性大鼠的动情周期。
   1. 准备设备和材料，包括洁净的玻璃显微镜载玻片、直径2 mm的棉签、生理盐水（0.9% NaCl）和显微镜。
   2. 用日期和大鼠编号标记每张显微镜载玻片。
   3. 下午6点至7点之间，为尽量减少应激反应，需轻柔地固定雌性大鼠。用拇指和食指捏住尾根部，同时用其余手指对大鼠腰椎施加压力。
   4. 抬起尾巴末端，暴露阴道口。用生理盐水润湿棉签，将棉签尖端插入阴道内，轻轻旋转以采集阴道分泌物。
   5. 将拭子尖端在载玻片上滚动涂抹，避免在同一区域重复涂抹。
   6. 在显微镜下观察涂片，使用低倍物镜（10x）定位并观察细胞。
      注意：在动情期，阴道分泌物中较大的上皮细胞核消失，被积累成堆的鳞状脱落角化上皮细胞所取代。
   7. 记录每只大鼠的动情周期阶段。
4. 晚上7点至8点之间，将一只雄性大鼠和一只雌性大鼠放入交配笼中。
   注意：用于交配的雌性大鼠需处于动情前期或动情期。
5. 第二天上午7至8点之间，检查交配笼内是否有交配栓。若在交配笼底部发现交配栓，则按照步骤1.3.4–1.3.6所述方法，对雌性大鼠制备阴道分泌物涂片。
   注意：交配栓是由雄性大鼠精囊和前列腺分泌物与雌性阴道分泌物混合后形成的乳白色或微黄色凝胶状物质。
6. 确认雌性大鼠的妊娠状态： 在交配笼中发现交配栓后，观察阴道分泌物涂片中的精子。将这一天定为妊娠第1天（GD1）。
7. 将怀孕的大鼠隔离至单独的笼子中。
   注意：在妊娠初期，必须防止怀孕大鼠接触环境中陌生雄性个体的化学信号，或与陌生雄性大鼠同笼饲养。
8. 大鼠的妊娠期通常持续21至23天。从妊娠第1天（GD1）到第20天（GD20）测量并记录大鼠的体重。
9. 在妊娠第20天，将怀孕大鼠的笼子更换为清洁的笼子，并在笼内放置医用吸水棉（大小与大鼠相近）。提供足量的食物和水，满足七天的生存需求，并将笼子置于安静处。
   注意：大鼠分娩后至少 1 周内不要更换笼具。更换至清洁笼具时，需将脏笼中使用过的吸水棉转移到新笼中，以确保大鼠能够识别其后代的气味。
10. 第21天^st 产后第1天，按性别将后代分笼饲养，分别置于两个笼子中。
    注意：由于21日龄子代体型较小，需将硬质饲料颗粒放入玻璃培养皿中，再置于笼内。

2. 产前游泳训练方案

1. 对所有实验用雌性大鼠进行为期5天的适应性训练。
   1. 准备一个高度至少为20 cm的透明塑料容器，并加入10 cm深、温度为34 ± 1°C的水。
   2. 抓住大鼠尾尖将其提起，然后将其放入水中。
   3. 在15分钟的适应性训练期间，每5分钟密切监测一次水温，并添加温水以维持温度。
   4. 训练结束后，将大鼠转移至另一容器中温度为34 ± 1°C的清洁水中清洗毛发，随后将其放入铺有毛巾的笼子中，并使用吹风机将毛发吹干。
      注意：噪音和高温环境可能引起大鼠应激反应。因此，建议使用可调节温度且运行安静的吹风机。
   5. 将大鼠妥善送回各自的笼中。
2. 大鼠交配（按步骤1.3–1.6操作）。
3. 在完成步骤1.7后，将妊娠大鼠随机分为静息对照组（SED）和运动组（EX）。
4. 每次训练前每日称量大鼠体重。
   注意：在适应性训练期间，大鼠每日体重减轻不应超过3 g。在产前训练期间，大鼠体重应逐渐增加。若大鼠每日体重减少超过3 g，应将每日训练时间减少50%，以利于恢复。
5. 对EX组大鼠从妊娠第1天（GD1）至妊娠第20天（GD20）进行产前游泳训练，每周6天，每天上午8:00至9:00。
   1. 准备一个直径为50 cm、最小高度为50 cm的圆形水桶，加入40 cm深、温度为34 ± 1°C的水。
   2. 从GD1至GD5，初始游泳训练时间为每天20分钟，并逐步增加至每天60分钟。
   3. 从GD6至GD20，继续每天训练60分钟，每周6天。
   4. 后续护理参照步骤2.1.4–2.1.5。
   5. 运动结束后，给予EX组大鼠5 g啮齿类专用葵花籽，以提供营养支持。
6. 在EX组每日训练期间，将SED组大鼠置于与适应性训练相同的水环境中（见步骤2.1.1），使其在水中停留的时间与EX组相同。运动结束后，给予SED组大鼠5 g啮齿类专用葵花籽，以提供营养支持并安抚情绪。
7. 每次游泳训练结束后，使用紫外线对所有设备（包括水桶和毛巾）进行清洁和消毒。

3. 胎儿的生理特征

1. 在妊娠第20.5天上午，使用3%异氟烷麻醉雌性大鼠，并在CO₂窒息箱中实施安乐死。
2. 使用手术刀在大鼠下腹部做切口。确保切口向腹部两侧倾斜，以充分暴露子宫。
3. 使用镊子和剪刀小心打开子宫，暴露胎鼠和胎盘。用镊子轻轻分离包裹胎鼠的薄层羊膜，避免使用剪刀时对胎鼠和胎盘造成损伤。
4. 用无菌纱布清洁胎鼠身体，去除血液和黏液。根据解剖位置依次分离胎鼠和胎盘，然后称重。
5. 观察肛门与生殖器之间的距离以判断胎鼠性别。雄性胎鼠的距离大于雌性。记录胎鼠性别及数量，以供后续参考。
6. 将胎鼠平放后使用游标卡尺测量其体长。由于胎鼠仍有生命活动，解剖后可能蜷缩，因此需将其身体展开后再进行测量。
   注意：为确保实验结果的一致性及测量方法的统一，整个实验过程由同一名实验人员按照相同标准操作。胎鼠按照机构推荐的指南实施安乐死，必要时采集组织样本用于进一步分析。

结果

在大鼠繁殖方法部分（图1）中，我们通过制备阴道分泌物涂片来确定雌性大鼠的动情周期，以提高繁殖成功率。大鼠的动情周期持续4-5天，包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期。处于动情后期或动情间期的雌性大鼠会表现出远离雄性等行为；而处于动情期的大鼠则愿意交配，且雌性大鼠的排卵大多发生在动情期末期。在动情前期，阴道涂片样本主要含有有核上皮细胞，偶见角化细胞；在动情期，阴道涂片主要由成堆聚集的角化鳞状上皮细胞组成，且动情后期所见的上皮细胞肿大细胞核已消失；在动情后期，阴道涂片主要含有白细胞及少量角化上皮细胞；动情间期的特征是白细胞占主导，偶见有核上皮细胞和角化上皮细胞（图1A）。

交配栓是由阴道分泌物和精液组成的凝胶状物质。雌性大鼠形成交配栓以防止其他雄性大鼠再次交配，同时堵塞雌性大鼠的阴道，防止雄性大鼠的精子流出。交配栓的存在并不一定表示成功配种，而仅表明发生了交配行为。因此，有必要在交配后的第二天早晨再次对雌性大鼠进行阴道涂片检查。若在阴道涂片中观察到精子，则表明配种...

讨论

本研究旨在建立一种可行的妊娠期大鼠运动方案，包括详细的大鼠交配方法、游泳训练方案以及用于评估胎儿生理指标的研究方法。通过实践，我们已建立了一种产前游泳运动训练模型，并针对方案中可能出现的潜在问题提供了相应的解决方案（表1）。该方案将更具实用性，有助于研究人员建立产前运动模型。

我们的研究结果表明，采用我们设计的大鼠妊娠期游泳训练方案不会干扰大鼠正常的妊娠过程，也不会导致不良妊娠结局。通过检测流产率和每窝仔鼠数量，评估了产前运动对大鼠妊娠结局的影响。研究得出结论：产前运动对这些因素未产生显著影响^15,16。为了研究胎儿情况，研究人员在妊娠第20.5天（GD20.5）解剖妊娠大鼠以获取胎儿样本。解剖过程中需收集胎儿和胎盘，并准确记录每窝后代数量，以确定妊娠结局，这要求统计胎儿数目并测量胎儿体长。此外，胎盘效率定义为胎儿体重与胎盘体重的比值，因此需要同时测量胎儿和胎盘的重量。我们先前的研究结果表明，产前运动对胎儿体长无显著影响，但在高血压...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
游标卡尺	三丰精密量仪（上海）有限公司	530-101 N15	胎儿解剖
圆形水桶	纳利雅	N/A	大鼠游泳
实验手术器械	深圳瑞沃德生命科技有限公司	SP0001-G	胎儿解剖
玻璃显微镜载玻片	江苏世泰实验器材有限公司	80312-3161	阴道涂片
玻璃培养皿	默克生命科技	BR455751-10EA	子代饲养
吹风机	松下	EH-WNE5H	游泳后护理
信息卡	中科生命科学	SS3	大鼠交配
异氟烷	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R510-22-10	胎儿解剖
光学显微镜	奥林巴斯	IX71-F22PH	阴道涂片
交配笼	中科生命科学	SS3	大鼠交配
医用吸水棉	宏祥卫生材料有限公司	N/A	妊娠大鼠待产
啮齿类动物麻醉机（气体麻醉）	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500IE	胎儿解剖
啮齿类动物繁殖饲料	北京华阜康生物技术有限公司	1032	妊娠大鼠喂养
啮齿类动物维持饲料	北京华阜康生物技术有限公司	1022	子代饲养
啮齿类动物葵花籽	乔利	JP241	营养补充
隔音棉	库夫医疗仪器	N/A	妊娠大鼠待产
无菌棉签（2 mm 直径）	库夫医疗仪器	N/A	阴道涂片
无菌纱布	库夫医疗仪器	N/A	胎儿解剖
生理盐水溶液（0.9% NaCl）	山东华鲁制药有限公司	N/A	阴道涂片
温度计	Beekman organism	N/A	大鼠游泳监测
毛巾	Grace	N/A	游泳后护理
透明塑料容器	纳利雅	N/A	游泳适应性训练
紫外线灯	默克生命科技	Z169633-1EA	游泳后护理
热水器	海尔	EC6001-Q6S	大鼠游泳
体重秤	Electronlc Acale	JM.A10001	体重测量
Wistar 大鼠	维通利华实验动物技术有限公司	N/A	实验