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Article de méthode

Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

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DOI :

10.3791/66579

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6 septembre 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une procédure expérimentale détaillée pour reconstituer des attaches d’ADN contenant des nucléosomes pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique. Il décrit en outre plusieurs expériences en aval qui peuvent être menées pour visualiser le comportement de liaison des protéines interagissant avec la chromatine et analyser les changements dans les propriétés physiques des nucléosomes.

Résumé

Les nucléosomes constituent l’unité primaire de la chromatine eucaryote et ont fait l’objet de nombreuses études informatives sur des molécules uniques concernant leurs propriétés biophysiques et leurs interactions avec les protéines de liaison à la chromatine. La reconstitution des nucléosomes sur l’ADN pour ces études implique généralement une procédure de dialyse au sel qui fournit un contrôle précis sur le placement et le nombre de nucléosomes formés le long d’un lien d’ADN. Cependant, ce protocole prend du temps et nécessite une quantité substantielle d’ADN et d’octamères d’histones comme entrées. Pour offrir une stratégie alternative, une méthode de reconstitution in situ des nucléosomes pour la microscopie à force de force et de fluorescence à molécule unique qui utilise le chaperon d’histones Nap1 est décrite. Cette méthode permet aux utilisateurs d’assembler des nucléosomes sur n’importe quelle matrice d’ADN sans avoir besoin de fortes séquences de positionnement de nucléosomes, d’ajuster la densité des nucléosomes à la demande et d’utiliser moins de réactifs. La formation de nucléosomes in situ se produit en quelques secondes, offrant un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des mesures à molécule unique. Des exemples de deux tests en aval pour sonder la mécanique des nucléosomes et visualiser le comportement de protéines individuelles sur la chromatine sont décrits plus en détail.

Introduction

L’unité d’emballage primaire de la chromatine eucaryote est le nucléosome, dans lequel ~147 paires de bases (pb) d’ADN sont enroulées autour d’un octamère des protéinesd’histones centrales 1,2. En plus de l’empaquetage du génome, l’architecture des nucléosomes sert d’autre couche riche de régulation biophysique qui peut être exploitée par les protéines de liaison à la chromatine lors de l’exécution de leurs diverses fonctions 3,4. L’accès expérimental et la mesure des caractéristiques physiques des nucléosomes ont été techniquement difficiles, car ces unités fonctionnent à des échelles minuscules (par exemple, longueurs nanométriques, forces du piconewton), et donc, leur sondage nécessite une sensibilité et une précision suffisantes pour informer de manière significative la fonction. De plus, les protéines de liaison à la chromatine interagissent souvent avec leurs substrats de manière transitoire, et la plupart des approches d’ensemble manquent de résolution temporelle appropriée pour informer la cinétique de ces interactions5. Heureusement, l’avènement des techniques à molécule unique a permis de visualiser et de manipuler des protéines individuelles et leurs interactions en temps réel, révélant des informations mécanistes sur ces événements moléculaires se produisant à l’échelle nanométrique6. En particulier, la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique (smCFFM) exploite à la fois la détection de fluorescence à haute résolution et les outils de manipulation de force pour résoudre simultanément la mécanique, la composition et la coordination de la chromatine et des complexes chromatine-protéine 7,8.

Dans le smCFFM qui utilise spécifiquement des « pinces optiques » comme méthode de manipulation de force, un laser à focalisation serrée est utilisé pour piéger un objet diélectrique, généralement une bille de plastique de la taille d’un micron, en trois dimensions9. Un biopolymère tel qu’un morceau d’ADN peut être conjugué à la bille (via, par exemple, la liaison streptavidine-biotine, digoxigénine-anti-digoxigénine), et l’utilisateur peut à la fois appliquer une force calibrée et mesurer la force/déplacement généré par le système10. Le module de fluorescence ajouté permet une imagerie de fluorescence multicolore simultanée pour suivre la composition et le comportement des protéines.

La méthode principale de reconstitution de matrices de nucléosomes pour le smCFFM consiste à assembler des nucléosomes sur des matrices d’ADN personnalisées par dialyse au sel 11,12,13. Dans cette procédure, des octamères d’histones purifiés sont incubés avec des matrices d’ADN dans un tampon à haute teneur en sel (~1 M de chlorure de sodium), et à mesure que le sel est lentement dialysé, les nucléosomes s’assemblent spontanément sur l’ADN d’une manière positionnelle dépendante de la séquence14,15. En tant que tel, il est habituel que des séquences de positionnement de nucléosomes fortes (par exemple, Widom 60116, X. laevis 5SrDNA 17) soient incorporées dans les matrices d’ADN pour générer des réseaux de nucléosomes personnalisés. Bien que cette méthode bien établie offre un contrôle précis sur le placement et le nombre de nucléosomes dans l’ADN, elle souffre de plusieurs inconvénients : (1) l’incorporation de séquences d’ADN à positionnement fort des nucléosomes peut générer des nucléosomes artificiellement stables qui biaisent l’activité des protéines de liaison à la chromatine, (2) le processus de dialyse au sel pour la formation des nucléosomes nécessite de grandes quantités d’ADN et d’octamères, et (3) la procédure prend un à plusieurs jours de travail ainsi qu’un effort considérable pour titrer le rapport ADN/octamère correct pour une densité optimale de réseau de nucléosomes.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode alternative pour former des nucléosomes le long de l’ADN in situ dans un microscope à force corrélative et à fluorescence à molécule unique en utilisant le chaperon d’histones recombinant Nap1, qui ressemble à la voie physiologique de la formation des nucléosomes in vivo 18,19,20,21,22. Cette méthode permet aux utilisateurs d’assembler des nucléosomes sur des séquences d’ADN non spécifiques, d’ajuster facilement la densité des nucléosomes et d’utiliser beaucoup moins de réactifs, le tout en quelques minutes. De plus, la formation d’attaches d’ADN nucléosomale in situ permet un flux de travail expérimental plus simple et la commodité de la visualisation et de la manipulation intégrées de molécules uniques. Ainsi, lorsque le positionnement uniforme et spécifique des nucléosomes n’est pas une nécessité, ce protocole offre une option utile pour l’étude de la mécanique des nucléosomes ou du comportement des protéines sur la chromatine, pour lesquels nous décrivons également des exemples de dosages.

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Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’ADN biotinylé

  1. Préparez une réaction volumique de 120 μL contenant 20 μg d’ADN λ, 33 μM de biotine-dCTP, 33 μM de biotine-dUTP, 33 μM de biotine-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unités d’enzyme Klenow et 1 tampon NEB 2.
    REMARQUE : Cette procédure utilise spécifiquement de l’ADN génomique linéaire double brin (ds) sans méthylation du bactériophage λ (48 502 bps), qui contient 12 nucléotides (nt) 5' monocaténaire (ss)23. Cependant, le protocole peut être adapté pour utiliser n’importe quelle longueur ou séquence d’ADNdb linéaire à condition qu’il contienne au moins plusieurs nts de surplombs ss 5', la longueur et la séquence nt dictant le nombre de nts biotinylés installés à chaque extrémité pour l’attache en aval entre les pièges optiques. De plus, la réaction peut être réduite. Par exemple, 5 μg d’ADN peuvent être utilisés dans une réaction de 30 μL de volume. De plus, les substrats d’ADN générés de cette manière ne sont pas contraints en torsion. Pour les protocoles permettant de créer de l’ADN sous contrainte de torsion, veuillez vous référer aux rapports publiés précédemment24,25.
  2. Incuber la réaction à température ambiante pendant 15 min.
  3. Ajouter 10 mM d’EDTA et incuber à 75 °C pendant 20 min.
  4. Effectuer une précipitation de l’éthanol pour obtenir le produit d’ADN biotinylé.
    1. Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M et 3 volume d’éthanol 100 % glacé. Conserver à -20 °C pendant au moins 1 h jusqu’à toute la nuit. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 30 min à 4 °C.
    2. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille et ajoutez 1 ml d’éthanol à 75 %. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 1 min à 4 °C.
    3. Répétez les étapes d’élimination du surnageant, d’ajout d’éthanol et de centrifugation.
    4. Retirez soigneusement tout le surnageant et laissez sécher les granulés à l’air libre pendant 10 min. Dissoudre la pastille dans 100-200 μL de tampon TE ou ddH2O (peut incuber à 37 °C pour faciliter la dissolution). Mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop.

2. Préparation des canaux dans une cellule d’écoulement

REMARQUE : Cette procédure est basée sur une puce microfluidique disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) mais peut être adaptée à tout instrument smCFFM doté d’une cellule d’écoulement multicanaux.

  1. Canaux passivants (ch.) 4 et 5 (ou n’importe quel canal contenant des protéines) (voir schéma des canaux dans la figure 1A). Ajouter 500 μL de BSA à 0,1 % dans chaque canal et laisser couler à 0,8 bar (~0,45 μL/s pour un tube d’un diamètre intérieur de 0,010 pouce) pendant 8 min. Retirer la solution.
  2. Ajouter 500 μL de Pluronic-F127 à 0,05 % dans chaque canal et laisser couler à 0,8 bar pendant 8 min. Retirez la solution et rincez les seringues avec 1x PBS. Ajouter 2 mL de 1x PBS dans chaque canal et laisser couler à 0,8 bar pendant 27 min.
  3. Vortex la solution mère de billes enrobées de streptavidine (cette procédure utilise des billes de 3,13 μm) et ajoutez 2,15 μL de la solution de billes à 1 mL de 1x PBS. Ajouter au ch. 1.
    REMARQUE : La taille et la concentration des billes enrobées de streptavidine peuvent être ajustées selon les préférences de l’utilisateur.
  4. Ajoutez 30 à 80 ng d’ADN λ biotinylé à 1 ml de PBS 1x. Ajouter au ch. 2.
    REMARQUE : La concentration d’ADN biotinylé peut être ajustée selon les préférences de l’utilisateur. De plus grandes quantités d’ADN augmenteront la fréquence de formation des attaches d’ADN, mais augmenteront également la fréquence de l’attache de plusieurs molécules d’ADN à la fois, ce qui peut ajouter à la difficulté de l’expérience.

3. Formation de nucléosomes in situ médiée par Nap1

  1. Ajouter 500 μL de tampon d’image sans protéines au chapitre 3.
    REMARQUE : La composition tampon du chapitre 3 est flexible et devrait convenir à la fois aux nucléosomes et à la ou aux protéines spécifiques d’intérêt. En option, les utilisateurs peuvent choisir d’ajouter des systèmes de piégeage de l’oxygène pour réduire le photoblanchiment des fluorophores et/ou de l’ADN concurrent pour éliminer les octamères d’histones qui ne sont pas correctement enveloppés dans les nucléosomes.
  2. Ajouter 2 nM de S. cerevisiae Nap1 et 2-5 nM d’octamère d’histones H4 (HO) marqué au LD655 à 500 μL de 1x tampon HR18. Ajouter au ch. 4.
    REMARQUE : Les octamères d’histone et le Nap1 peuvent être achetés dans le commerce ou préparés sur place (voir le tableau des matériaux). Le nombre de nucléosomes à former le long de chaque ADN attaché dépend de la concentration d’octamères ainsi que du temps passé dans ce canal. La densité nucléologique souhaitée et approximative de l’utilisateur le long de chaque molécule d’ADN peut être modulée en ajustant l’un ou l’autre de ces paramètres ou les deux. De plus, l’utilisateur peut choisir d’étiqueter les octamères d’histones avec son fluorophore préféré.
  3. Facultatif : Ajouter la protéine de liaison à la chromatine ou une autre protéine d’intérêt au chapitre 5 dans un tampon approprié.
  4. Écoulement de tous les canaux à 1,0 bar (~0,55 μL/s dans la configuration expérimentale actuelle) pendant 30 s pour rincer les canaux de la cellule d’écoulement avec des échantillons.
  5. Réglez le débit à 0,2 bar (~0,16 μL/s dans la configuration expérimentale actuelle). Déplacez les pièges optiques (OT) vers le canal 1 et attrapez une paire appropriée de billes enrobées de streptavidine.
  6. Déplacez les OT sur le canal 3, effectuez un étalonnage de force pour la paire de billes, allumez le laser confocal rouge (ou une autre ligne laser de votre choix) et calibrez la zone d’imagerie.
  7. Réglez le débit sur 0,2 bar et déplacez les ergothérapeutes sur le canal 2. Attrapez l’ADN biotinylé.
  8. Déplacez les OT sur le ch. 3 et arrêtez le flux. Augmentez la distance entre les OT pour étirer l’ADN et surveillez la courbe force-distance (FD) associée pour confirmer la présence d’un seul lien d’ADN (par opposition à plusieurs fils). La courbe doit suivre le modèle de chaîne vermoulue pour l’ADNdb à la longueur de contour donnée26.
  9. Ajustez la distance entre les OT de sorte que la tension de l’ADN soit d’environ 1 pN.
    REMARQUE : Une tension de 1 pN est suffisamment faible pour permettre aux nucléosomes de rester enveloppés par l’ADN27 , mais elle est suffisamment élevée pour placer la molécule d’ADN entière dans l’axe d’imagerie du balayage de ligne.
  10. Activez le balayage en ligne pour commencer à collecter un kymographe avec le laser rouge allumé.
    REMARQUE : Des kymographes ou des scans 2D d’ADN attaché peuvent être obtenus, selon les préférences de l’utilisateur.
  11. Déplacez les OT au ch. 4 avec le flux coupé. Grâce à Nap1, les HOs sont chargés sur l’ADN et enveloppés pour former des nucléosomes en temps réel. La charge nucléosomique est visualisée sous forme de trajectoires fluorescentes apparaissant sur l’ADN à l’intérieur des kymographes. Parallèlement, la formation de nucléosomes sur l’ADN peut être surveillée par l’augmentation de la force à mesure que davantage de HOs sont chargés lorsque les positions des OT sont maintenues constantes.
    REMARQUE : Le laser d’excitation de fluorescence peut être désactivé pendant les étapes de formation des nucléosomes pour éviter le photoblanchiment des fluorophores. De plus, la liaison non spécifique des octamères d’histones à l’ADN dans laquelle les octamères ne sont pas enveloppés dans des nucléosomes pourrait se produire à l’aide de ce protocole. Ces événements de liaison ne génèrent pas de « déchirure » lorsque l’ADN est étiré, comme décrit dans le protocole de déballage des nucléosomes (étape 4) ci-dessous, et peuvent parfois être éliminés par un léger flux tampon, en particulier si le tampon contient de l’ADN concurrent libre.
  12. Lorsque le nombre approximatif souhaité de nucléosomes est formé, commencez à collecter des données.

4. Déballage des nucléosomes

  1. Terminez les étapes 2 et 3.
  2. Après avoir formé un lien d’ADN contenant des nucléosomes, déplacez les OT vers le canal 3.
  3. Préparez-vous aux expériences de déballage de nucléosomes en réduisant la distance entre les OT jusqu’à ce que la force soit approximativement nulle. Zéro la force.
  4. Commencez à éloigner l’OT 1 de l’OT 2 à une vitesse constante de 0,1 μm/s. Sur un kymographe, la perle de l’OT 1 s’éloignera visuellement de la perle de l’OT 2. Sur la courbe FD, la force augmentera à mesure que la distance augmente. Au fur et à mesure que les nucléosomes se déballent, il y aura des « déchirures » ou des transitions dans la force (~8-37 pN) qui signifient le dénouement de l’enveloppe interne des nucléosomes individuels 27,28,29.
    REMARQUE : La force à laquelle le déballage se produit dépend de la vitesse de traction, qui est attendue pour les processus hors équilibre. Parfois, plusieurs nucléosomes se déballent en même temps, produisant un changement de distance plus important dans la transition sur la courbe FD. De plus, l’effilochage de l’enveloppe externe du nucléosome n’est pas facilement visible dans ce cadre expérimental (voir la section Discussion).

5. Visualisation de la liaison des protéines à la chromatine

  1. Terminez les étapes 2 et 3.
  2. Ajoutez 10 nM d’histone H1.4 de linker marquée Cy3 à 500 μL de tampon d’image dans le ch. 5.
    REMARQUE : Toute protéine d’intérêt peut être ajoutée au canal 5 à une concentration de choix (généralement inférieure à 100 nM pour la visualisation d’une seule molécule).
  3. Après avoir formé un lien d’ADN contenant des nucléosomes, allumez le laser vert en plus du laser rouge et déplacez les OT sur le canal 5 pour une imagerie en temps réel de la liaison de H1 à la chromatine.
  4. Continuez à collecter des kymographes ou des scans jusqu’à ce que des statistiques suffisantes aient été obtenues (au moins ~10-20 kymographes selon la fréquence des événements et la difficulté expérimentale).

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Résultats

À l’aide de la configuration décrite à l’étape 3 (figure 1A), la formation de nucléosomes le long du lien d’ADN a été visualisée sous la forme de foyers fluorescents rouges sur un balayage 2D (figures 1B, à gauche) ou de trajectoires dans le temps sur un kymographe (figure 1B, à droite). Des nucléosomes correctement enveloppés ont produit des trajectoires de fluorescence qui étaient stationnaires dans le temps à l’intérieur de la li...

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Discussion

Le protocole décrit offre plusieurs avantages pour la reconstitution des nucléosomes, notamment la minimisation des réactifs et du temps, ainsi que la formation de nucléosomes dépendants des chaperons le long de n’importe quelle séquence d’ADN (potentiellement native). De plus, la méthode in situ permet un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des dosages à molécule unique de la mécanique des nucléosomes et de l’interaction protéine-chromatine....

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

G. N. L. C. reconnaît le soutien du National Institute of Mental Health des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix F31MH132306. S. L. est soutenu par la Fondation Robertson, la Fondation internationale du syndrome de Rett et le NIH (numéro de bourse R01GM149862).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x tamponHR N/AN/A30 mM  ; tris  ; acétate pH 7,5, 20 mM d’acétate de magnésium, 50 mM de chlorure de potassium, 0,1 mg/mL de BSA.
1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate)N/AN/A137 mM chlorure de sodium, 2,7 mM chlorure de potassium, 10 mM phosphate de sodium dibasique, 1,8 mM phosulfate de potassium monobasique.
Acide acétique, glacialMillipore SigmaAX0074-6Utiliser pour fabriquer du tris acétate
Biotine-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotine-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotine-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Albumine sérique bovineMillipore SigmaA9418-50GDissoudre dans H2O et passage à travers un filtre de 0,22 μm
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimide fonctionnalisé Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Centrifugeuse de paillasse avec refroidissement
Alcool éthylique,Millipore Sigmapur 459844
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Millipore SigmaE9884Dissoudre dans H2O à 0,5 M
Octamère d’histones humaines (H4, L50C ; H2A, K119C)  ;N/AN/Aprotéines d’histones recombinantes et celles hébergeant des mutations de marquage ont été purifiées en interne comme décrit précédemment (voir réf. 33, 34, 35, 36). En bref, les histones recombinantes ont été exprimées dans les cellules pLySS BL21 (De3) (Promega). Les corps d’inclusion ont été isolés après sonication, et les histones ont été extraites dans des conditions de dénaturation. Les histones ont été dialysées dans le tampon A (7 M d’urée, 10 mM de chlorhydrate de tris pH 8,0, 100 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’EDTA et 5 mM de 2-mercaptoéthanol), et la solution a été ajoutée à une colonne gravitaire chargée de Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). L’écoulement a ensuite été ajouté à une colonne de gravité SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), et les histones ont été éluées de la colonne en ajoutant le tampon A complété par 600 mM de chlorure de sodium. Des histones porteuses de mutations de marquage (H4, L50C ; H2A, K119C) ont été purifiés puis conjugués au fluorophore souhaité via des colorants fonctionnalisés par maléimide (Cytiva, Lumidyne) en utilisant un rapport molaire colorant/protéine de 20:1 (voir réf. 33, 34). Les octamères d’histones ont été assemblés en ajoutant un rapport molaire égal de chaque histone de type sauvage ou marquée au fluorophore dans des conditions de dénaturation, dialysés dans un tampon à haute teneur en sel contenant 2 M de chlorure de sodium, puis purifiés par chromatographie d’exclusion stérique comme décrit précédemment (voir réf. 36, 37). Alternativement, des protéines d’histones individuelles et des octamères d’histones prêts à l’emploi peuvent être achetés dans le commerce (par exemple, Epicypher).  ;
Tampon d’imageN/AN/A20 mM chlorhydrate de tris pH 8,0, 100 mM chlorure de sodium
Fragment de Klenow (3' à 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Sans méthylation &lambda ; ADN
LD655-MALLumidyne Technologies9Maléimide Fluorophore LD655 fonctionnalisé
Linker histone H1.4 (A4C)N/AN/AProtéine recombinante purifiée fabriquée en interne (voir réf. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AConfiguration à double piège ; matériaux standard pour l’instrument fournis par le fabricant
Solution d’acétate de magnésiumMillipore Sigma63052-100MLÀ utiliser pour fabriquer un tampon HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SInclus avec le kit de fragments Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDissoudre dans H2O et passer à travers un filtre de 0,22 um
Chlorure de potassiumMillipore SigmaP3911Utilisation pour fabriquer un tampon PBS et HR
Phosphate de potassium monobasiqueMillipore SigmaP0662À utiliser pour fabriquer du PBS
em>S. cerevisiae Nap1N/A/ANap1 a été purifié en interne comme décrit précédemment (voir réf. 33, 34). Alternativement, Nap1 peut être acheté dans le commerce (par exemple, Active Motif).
Acétate de sodiumMillipore Sigma241245Dissoudre dans H2O à 3 M
Chlorure de sodiumMillipore SigmaS9888Utilisation pour fabriquer du PBS et un tampon d’image
Phosphate de sodium dibasiqueMillipore SigmaS9763Utilisation pour fabriquer des
particules enrobées de biotine PBS SPHERO (3.0-3.4 µ ; m)Spectrophotomètre SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c FisherScientificND2000Spectrophotomètre NanoDrop
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Dissoudre dans H2O et ajuster au pH approprié ; utiliser pour faire du tampon d’image et du tris acétate
Les < N

Références

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