פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8
במאמר זה
סיכום
תקציר
התגובה החיסונית הנרכשת מסתמכת על יכולתו של תא T לנדוד דרך דם, לימפה ורקמות בתגובה לפתוגנים ולגופים זרים. נדידת תאי T היא תהליך מורכב הדורש תיאום של קלטי אותות רבים מהסביבה ומתאי מערכת החיסון המקומית, כולל כימוקינים, קולטני כימוקין ומולקולות הידבקות. יתר על כן, תנועתיות תאי T מושפעת מרמזים סביבתיים דינמיים, שיכולים לשנות את מצב ההפעלה, נוף השעתוק, ביטוי מולקולות ההיצמדות ועוד. In vivo, המורכבות של גורמים אלה השלובים לכאורה זה בזה מקשה להבחין באותות בודדים התורמים לנדידת תאי T. פרוטוקול זה מספק שורה של שיטות מבידוד תאי T ועד ניתוח בעזרת מחשב כדי להעריך נדידת תאי T בזמן אמת בתנאים סביבתיים ספציפיים ביותר. תנאים אלה עשויים לעזור להבהיר מנגנונים המווסתים את הנדידה, לשפר את הבנתנו את הקינטיקה של תאי T ולספק ראיות מכניסטיות חזקות שקשה להשיג באמצעות ניסויים בבעלי חיים. הבנה עמוקה יותר של האינטראקציות המולקולריות המשפיעות על נדידת תאים חשובה לפיתוח טיפולים משופרים.
מבוא
תאי T הם הגורמים העיקריים לתגובה חיסונית נרכשת, ספציפית לאנטיגן. ברמת האוכלוסייה, תאי T הם הטרוגניים, המורכבים מתת-קבוצות תאיות בעלות פונקציות מיוחדות שונות. חשוב לציין, תאי CD8+ T הם המשפיעים הציטוליטיים העיקריים של המערכת החיסונית, אשר מבטלים ישירות תאים נגועים או לא מתפקדים1.
תאי T בוגרים מסוג CD8+ שוכנים ברקמה וזורמים דרך הדם והלימפה בחיפוש אחר אנטיגנים. במהלך ההדבקה, תאי T מוצגים עם אנטיגנים בדם או ברקמה ומתנקזים במהירות לטחול או לבלוטת הלימפה המתנקזת הקרובה ביותר כדי להתחיל תגובה חיסונית פרודוקטיבית. בכל מקרה, תאי T מופעלים, עוברים הרחבה שבטית ועוזבים את מערכת הלימפה כדי להיכנס לדם, אם עדיין לא שם. במהלך תהליך ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה האוניברסיטאית למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. העכברים במחקר זה הוחזקו בחלל נטול הפתוגנים של מתקן בעלי החיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברי C57BL/6 זכרים/נקבות, בגילאי 6-12 שבועות (15-30 גרם), שימשו במחקר הנוכחי. בידוד רקמות עכבר יכול להתבצע על ספסל עם כפפות לכיסוי ידיים ומסכת פנים לכיסוי האף והפה, או בתוך ארון בטיחות ביולוגית. כל תרבית התאים והכנת הצלחת חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. טיהור והפעלה של תאי CD8+ T
- הכנת חומרים
- לברירה שלילית של תאי CD8+ T: הכינו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אישור להפעלת תאי T יכול להיות מושג על ידי ציטומטריית זרימה, המחפשת ביטוי מוגבר של CD69 ו- CD44, שהם סמנים קנוניים של הפעלה בתאי T מורין6. בנוסף, ניתן לקבוע את טוהר אוכלוסיית תאי T על ידי ציטומטריית זרימה עבור תאי CD3+ CD8+ T. שיטה זו מניבה >90% אוכלוסיית תאי CD8+ T.
ניתן להעריך את נדידת תאי T באמצעות תוכנות מעקב אחר תאים בסיוע תוכנה הניתנות לשחזור ואינן מתאימות לצרכי החוקר. כמה פרמטרים בסיסיים המשמשים לקביעת השפעות הניסוי כוללים מהירו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הבנת ההשפעה הביולוגית של התכנסות אותות in vivo היא מאתגרת ולא קלה לפרשנות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מספקים שיטה סבירה להבנת נדידת תאי T בתנאים מוגדרים מאוד ורלוונטיים ביולוגית. תנאים אלה יכולים להיות מוגדרים על פי שיקול דעתו של החוקר, וניתן לשנות את הפרוטוקולים כך שיתאימו לצרכים של אוכלוסיות תאי T שונות, מצב ההפעלה ופנוטיפ התא. יתר על כן, ליגנדים וקולטנים רבים יכולים להיחקר באמצעות הליכים מוגדרים אלה של חסימת נוגדנים 7,8 והליכים מצופים ליגנד
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי כל המחקר והכנת כתבי היד נעשו בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
תודות
אנו מודים לחברים קודמים ונוכחיים במעבדת קים שתרמו לפיתוח פרוטוקולים אלה לאורך זמן. הנתונים המייצגים התאפשרו על ידי P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States ו-P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States. פרסום זה התאפשר בחלקו הודות למענק מספר T32 GM135134 מטעם פרס שירות המחקר הלאומי ע"ש רות ל. קירששטיין.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת 10 ס"מ | קורנינג | 353003 | או שווה ערך |
| 15 מ"ל צינור חרוטי | ThermoFisher | 339650 | או שווה ערך |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | ללא סידן וללא מגנזיום |
| צלחת 6 בארות לא מטופלת | TC קורנינג | 3736 | או שווה ערך |
| 70 ומיקרו; מסננת תאים | m FisherScientific | 352350 | או שווה ערך |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | או שווה ערך |
| Allegra 6KR צנטריפוגה | ThermoScientific | sorvall 16R עם רוטור ודלי tx400 3655 | או שווה ערך |
| בטא מרקפטואתנול | Sigma | M3148 | או שווה ערך |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | או שווה ערך |
| צנטריפוגה | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | או שווה ערך |
| קולגן (IV) | קורנינג | 354233 | או שווה ערך |
| צלחת תרבית DeltaT בעובי .17 מ"מ זכוכית שקופה | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads כבשים נגד חולדות IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 מגנט | ThermoFisher מדעי | 12301D | או שווה ערך |
| ערכת בידוד תאי T עכבר קל sep תא | גזע | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | או שווה ערך |
| פיברונקטין | SigmaAldrich | 10838039001 | או שווה ערך |
| פיג'י | http://fiji.sc/ | weblink | |
| קוביות מסנן ניקון | או אולימפוס | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | או שווה ערך |
| HQ CCD מצלמה | CoolSNAP | או שווה ערך | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ תקע מעקב אוטומטי http://imagej.net/TrackMate | weblink | ||
| ImageJ מעקב ידני חבר https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | ||
| L-15 | שונים | ראה חומרים | מתכון בינוני: לייבוביץ' s L-15 בינוני ללא פנול אדום (Gibco) בתוספת 1-5 גרם/ליטר גלוקוז |
| מדיום L-15 של ליבוביץ, ללא פנול אדום | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok מזרק חד פעמי | Fisher Scientific | 14-955-459 | או שווה ערך |
| מדיום הפרדת לימפוציטים | Corning | 25-072-CI | או שווה ערך |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות | ThermoFisher | 11140050 | או שווה ערך |
| מערכת חימום מיקרוסקופ | Okolab | okolab.com | עיצובים מותאמים אישית זמינים |
| שקופית Millicell EZ שקופית | Millipore | C86024 | |
| Mojosort עכבר CD8+ Naï ערכת בידוד תאי T | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R& D systems | 8875-EC-050 | או שווה ערך |
| ערכת דיסקציה כירורגית לעכבר | Fisher Scientific | 13-820-096 | או שווה ערך |
| רכיבי NIS | Nikon | Software | |
| שאינו TC 24wp | Corning | 353047 | או שווה ערך |
| פניצילין-סטרפטומיצין | ThermoFisher | 15140122 | או שווה ערך |
| חלבון A | ThermoFisher Scientific | או שווה ערך | |
| R9 | מגוון ראה חומרים | מתכון בינוני: RPMI 1640x בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (Gibco), 20 מ"מ חוצץ HEPES (Gibco), 1% MEM חומצות אמינו לא חיוניות (Gibco), 50 μ M &-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) | |
| עכבר רקומביננטי ICAM-1 Fc כימרה | R& מערכות D | 796-IC-050 | או שווה ערך |
| עכבר רקומביננטי IL2 | Biolegend | 575410 | או שווה ערך |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 או שווה ערך | |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | או שווה ערך |
| TE2000-U מיקרוסקופ | ניקון | או שווה ערך | |
| כימוקין עכבר רקומביננטי שונה | & מערכות | או שווה ערך | |
| VCAM-1 Fc chimera | R& מערכות D | 643-VM-050 | או שווה ערך |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
מקורות
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
