Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.
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Articolo metodologico
Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie
In questo articolo
Sommario
Abstract
La risposta immunitaria adattativa dipende dalla capacità di una cellula T di migrare attraverso il sangue, la linfa e i tessuti in risposta a agenti patogeni e corpi estranei. La migrazione delle cellule T è un processo complesso che richiede il coordinamento di molti input di segnale provenienti dall'ambiente e dalle cellule immunitarie locali, tra cui chemochine, recettori per chemochine e molecole di adesione. Inoltre, la motilità delle cellule T è influenzata da segnali ambientali dinamici circostanti, che possono alterare lo stato di attivazione, il paesaggio trascrizionale, l'espressione delle molecole di adesione e altro ancora. In vivo, la complessità di questi fattori apparentemente intrecciati rende difficile distinguere i singoli segnali che contribuiscono alla migrazione delle cellule T. Questo protocollo fornisce una serie di metodi, dall'isolamento delle cellule T all'analisi assistita da computer, per valutare la migrazione delle cellule T in tempo reale in condizioni ambientali altamente specifiche. Queste condizioni possono aiutare a chiarire i meccanismi che regolano la migrazione, migliorando la nostra comprensione della cinetica delle cellule T e fornendo forti prove meccanicistiche difficili da ottenere attraverso esperimenti sugli animali. Una comprensione più profonda delle interazioni molecolari che influenzano la migrazione cellulare è importante per sviluppare terapie migliorate.
Introduzione
Le cellule T sono i principali effettori della risposta immunitaria adattativa antigene-specifica. A livello di popolazione, le cellule T sono eterogenee, composte da sottogruppi cellulari con funzioni specializzate distinte. È importante sottolineare che le cellule T CD8+ sono i principali effettori citolitici del sistema immunitario, che eliminano direttamente le cellule infette o disfunzionali1.
Le cellule T CD8+ mature risiedono nei tessuti e circolano nel sangue e nei linfatici alla ricerca di antigeni. Durante l'infezione, le cellule T vengono presentate con antigeni nel sangue o nei tessuti e drenano rapidamen....
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Protocollo
I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi in questo studio sono stati mantenuti nello spazio privo di agenti patogeni della struttura per animali dell'Università di Rochester. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi/femmine C57BL/6, di età compresa tra 6 e 12 settimane (15-30 g). L'isolamento del tessuto del topo può essere eseguito su un banco di lavoro con guanti per coprire le mani e una maschera facciale per coprire naso e bocca, o all'interno di una cabina di biosicurezza. Tutte le colture cellulari e la preparazione delle piastre devono essere eseguite i....
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Risultati
La conferma dell'attivazione delle cellule T può essere ottenuta mediante citometria a flusso, alla ricerca di un aumento dell'espressione di CD69 e CD44, che sono marcatori canonici di attivazione nelle cellule T murine6. Inoltre, la purezza della popolazione di cellule T può essere determinata mediante citometria a flusso per le cellule T CD3+ CD8+ . Questo metodo produce il >90 % della popolazione di cellule T CD8+ .
La migrazione .......
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Discussione
Comprendere l'impatto biologico dei segnali convergenti in vivo è impegnativo e non facile da interpretare. I protocolli qui presentati forniscono un metodo ragionevole per comprendere la migrazione delle cellule T in condizioni altamente definite e biologicamente rilevanti. Queste condizioni possono essere specificate a discrezione dello sperimentatore e i protocolli possono essere modificati per adattarsi alle esigenze delle varie popolazioni di cellule T, allo stato di attivazione e al fenotipo cellulare. Ino.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che tutte le ricerche e la preparazione del manoscritto sono state condotte in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri precedenti e attuali del Kim Lab che hanno contribuito allo sviluppo di questi protocolli nel tempo. Dati rappresentativi sono stati resi possibili da P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Stati Uniti e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Stati Uniti. Questa pubblicazione è stata resa possibile in parte dalla sovvenzione numero T32 GM135134 dall'Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto da 10 cm | Corning | 353003 | o equivalente |
| Provetta conica da 15 mL | ThermoFisher | 339650 | o equivalente |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | senza calcio e senza magnesio |
| Piastra a 6 pozzetti non trattata | TC Corning | 3736 | o equivalente |
| 70 &; filtro cellulare m | FisherScientific | 352350 | o tampone di |
| lisi ACK | ThermoFisher | A1049201 | o centrifuga |
| Allegra 6KR | ThermoScientific | sorvall 16R con rotore tx400 3655 e secchio | o equivalente |
| Beta mercaptoetanolo | Sigma | M3148 | o equivalente |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | O equivalente |
| Centrifuga | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | o equivalente |
| Collagene (IV) | Corning | 354233 | o |
| equivalente Piatto di coltura DeltaT .17 mm di spessore vetro trasparente | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | o equivalente |
| Kit di isolamento delle cellule T del topo Easy sep | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | o |
| equivalente Fibronectina | SigmaAldrich | 10838039001 | o equivalente |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Cubi filtranti | Nikon o Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | o |
| equivalente Telecamera CCD HQ | CoolSNAP | o equivalente | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h weblink | ||
| ImageJ inseguimento automatico plug-in | http://imagej.net/TrackMate | ||
| weblink ImageJ tracciamento manuale | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Vari | Vedi Materiali | Media Ricetta: Leibovitz' s Terreno L-15 senza rosso fenolo (Gibco) integrato con 1-5 g/L |
| di glucosio Terreno L-15 di Liebovitz, senza rosso fenolo | Siringa monouso ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok | Fisher Scientific | 14-955-459 | o equivalente |
| Terreno di separazione dei linfociti | Corning | 25-072-CI | o equivalente |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| Aminoacidi non essenziali MEM | ThermoFisher | 11140050 | o equivalente |
| Sistema di riscaldamento per microscopio | Okolab | okolab.com | Disegni personalizzati disponibili |
| Vetrino Millicell EZ | Millipore | C86024 | |
| Mouse Mojosort CD8+ Naï Kit di isolamento delle cellule T Biolegend | 480043 | ||
| Mouse E-caderina | R& Sistemi D | 8875-EC-050 | o equivalente |
| Kit di dissezione chirurgica del topo | Fisher | Scientific 13-820-096 | |
| elementi NIS | Software Nikon | ||
| non TC 24wp | Corning | 353047 | o equivalente |
| Penicillina-streptomicina | ThermoFisher | 15140122 | o |
| equivalente Proteina A | ThermoFisher Scientific | o equivalente | |
| R9 | Vari | Vedere Materiali | Medium Ricetta: RPMI 1640x integrato con il 10% di FBS, l'1% di antibiotico-antimicotico (Gibco), il tampone HEPES 20 mM (Gibco), l'1% di aminoacidi non essenziali MEM (Gibco), 50 μ M β-mercaptoetanolo (Sigma-Aldrich) |
| Topo ricombinante ICAM-1 Fc chimera | R& D systems | 796-IC-050 | o |
| equivalente Mouse ricombinante IL2 | Biolegend | 575410 | o |
| equivalente RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | o |
| pin T equivalenti Fisher | Scientific | S99385 | o equivalente |
| TE2000-U microscopio | Nikon | o equivalente | |
| Varie chemochine di topo ricombinanti | Re D o | equivalente | |
| VCAM-1 Fc chimera | R& D systems | 643-VM-050 | o software |
| Volocity | PerkinElmer |
Riferimenti
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al....
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Ristampe e permessi
