Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.
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Artigo de método
Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O coração de mamíferos é um órgão complexo formado durante o desenvolvimento por meio de populações altamente diversas de células progenitoras. A origem, o momento do recrutamento e o destino desses progenitores são vitais para o desenvolvimento adequado desse órgão. Os mecanismos moleculares que governam a morfogênese do coração são essenciais para a compreensão da patogênese das cardiopatias congênitas e da regeneração cardíaca embrionária. Abordagens clássicas para investigar esses mecanismos empregaram a geração de camundongos transgênicos para avaliar a função de genes específicos durante o desenvolvimento cardíaco. No entanto, a transgênese de camundongos é um processo complexo e demorado que muitas vezes não pode ser realizado para avaliar o papel de genes específicos durante o desenvolvimento do coração. Para resolver isso, desenvolvemos um protocolo para eletroporação e cultura eficientes de corações embrionários de camundongos, permitindo que a transgênese transitória avalie rapidamente o efeito do ganho ou perda de função de genes envolvidos no desenvolvimento cardíaco. Usando essa metodologia, superexpressamos com sucesso Meis1 no coração embrionário, com preferência pela transfecção de células epicárdicas, demonstrando as capacidades da técnica.
Introdução
O coração é o primeiro órgão formado durante o desenvolvimento embrionário. Este processo envolve a coordenação espaço-temporal de várias populações de células progenitoras de áreas distintas do embrião. Tudo isso ocorre enquanto o coração em desenvolvimento continua batendo e funcionando, enfatizando a notável coordenação necessária para sua formação 1,2,3. Dado o papel crucial do coração, a regulação rigorosa nos níveis celular e molecular é essencial para sua formação adequada 4,5. Identificar os mecanismos que con....
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da CNIC e em conformidade com a legislação vigente, incluindo a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE, conforme aplicado pela Lei Espanhola sob o Real Decreto 53/2013. Para este protocolo, foram empregadas fêmeas de camundongos CD-1 do tipo selvagem com idade entre 15 e 21 semanas. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de plasmídeo e ferramenta
- Primeiro, prepare a mistura de eletroporação adicionando o DNA plasmidi....
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Resultados
Para demonstrar a eficácia desta técnica na realização de experimentos de ganho de função (GOF) para reguladores relevantes do desenvolvimento cardíaco, uma construção foi eletroporada superexpressando o fator de transcrição Meis1. Para isso, o RNA foi extraído de embriões E9.5 e a transcrição reversa foi realizada para obter DNA complementar (cDNA). Usando o cDNA como modelo, a sequência codificadora Meis1 foi clonada (Tabela Suplementar 1) em um plasmídeo de expressão pCAG (doravante r.......
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Discussão
No geral, a metodologia descrita aqui oferece uma estrutura robusta para expressar construções transgênicas no epicárdio em desenvolvimento (Figura 4B), conforme demonstrado pela superexpressão de Meis1 (Figura 4C). Com as construções apropriadas, este protocolo pode ser usado para avaliar transitoriamente o impacto do ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) de um gene específico. O LOF pode ser implementado na técnica transfectando um plasmídeo direciona.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pela bolsa RTI2018-097617-J-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e Acción 9 da Universidad de Jaén para O.H.O. Concessão PGC2018-096486-B-I00 do Ministério de Ciência e Inovação da Espanha e bolsa H2020-MSCA-ITN-2016-722427 do programa Horizonte 2020 da UE para M.T. JMG foi apoiado por uma bolsa de doutorado do Ministério da Ciência da Espanha e da Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Tanto o CNIC quanto o CBMSO são apoiados pelo Ministério da Ciência da Espanha, e o CNIC é apoiado pela Fundação ProCNIC.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #55 Fórceps | Dumont | 11295-51 | |
| Placa de Cultura de Células Multipoços de Fundo Plano Transparente de 12 poços | BD Falcon | 353043 | |
| mesa de torno de 35 mm | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µ Filtro de Células M | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| Tubos de 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µ m Filtro de células | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Anticorpo Policlonal | Invitrogen | A10262 | diluição 1:1000 usado |
| Anti-Miosina 4 (MF20) Anticorpo Monoclonal | Invitrogen | 14-6503-82 | diluição 1:500 usado |
| CD1 Camundongos | Fornecido pela Unidade Animalária (CNIC) | ||
| Caspase-3 clivada (Asp175) Anticorpo | Sinalização Celular Tecnologias | 9661 | Diluição 1:400 usada |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | Diluição 1:1000 usada |
| Dispase/colagenase | Roche | 10269638001 | |
| Água | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Microscópio Estereoscópico Leica S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Extrator de Micropipeta Modelo P-97 | Instrumento Sutter | SU-P-97 | |
| plasmídeo de expressão pCAG | Addgene | #89689 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15070-063 | |
| Placas de Petri 35 &vezes; 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Placas de Petri 60 &vezes; 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Fenol Vermelho Pontas | |||
| Reutilizadas de equipamentos | |||
| Embrião de cultura de soro de rato, ratos machos SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Anticorpo recombinante anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) | Abcam | ab89901 | diluição 1:300 usado |
| Eletroporador de onda quadrada CUY21SC | Gene | Nepa CUY664-10X15 | |
| PBS | Fornecido e autoclavado pela unidade técnica | ||
| Sucrose | Eletrodos de pinça Millipore | 84100 | |
| com gap variável | Nepa Gene | CUY650P5 |
Referências
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. ....
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Reimpressões e permissões
