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方法文章

评估利用徒手切片和半薄切片技术对小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）中C3与C4光合作用差异的结构特征

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DOI：

10.3791/66843

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2024年7月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

本文内容

摘要

评估C3和C4植物叶片横切面之间的解剖学差异有助于理解光合作用效率。本文介绍了小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）这两种作物物种的徒手切片和半薄叶片横切片的制备与观察方法，并阐述了制备过程中需要注意的事项。

摘要

与C3光合作用机制相比，C4光合作用效率的提高源于其在维管束鞘细胞中浓缩CO2的能力。C4光合作用的有效性以及内在水分利用效率，直接与叶肉细胞和维管束鞘细胞的比例、 维管束鞘的大小和密度，以及维管束鞘细胞的大小、密度和细胞壁厚度相关。利用常规光学显微镜对徒手切片和半薄切片进行快速显微分析，可鉴定并观察特定细胞类型，从而获得有关C4作物光合效率的有价值信息。此外，本文还展示了在徒手切片和半薄切片制备过程中可能影响解剖学测量和细胞类型判断的常见错误，并说明了如何避免这些错误。该显微分析方法为研究光合作用对环境变化的适应性提供了高效手段，同时有助于对未来气候条件下的作物进行快速筛选。

引言

光合作用是一种将光能转化为化学能的基本过程，是陆地营养网络的基础。大多数植物采用C3光合途径，其主要光合产物为三碳化合物3-磷酸甘油酸。C3光合作用在20多亿年前演化形成，当时大气中CO2浓度较高而O2浓度较低1。在这种环境下演化而来的关键光合酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），在当前低CO2高O2的条件下表现欠佳，因其会与O2发生竞争性反应，从而启动光呼吸过程2。光呼吸是一种消耗能量而非产生能量的浪费性代谢途径，并以释放CO2作为副产物。因此，维持叶绿体中Rubisco周围的高CO2浓度以防止加氧反应至关重要3,4。由于C3植物无法浓缩CO2，从环境空气到叶绿体之间存在显著的CO2浓度下降，限制了光合作用，影响植物生长和生物量积累2,5,6。

在C3植物中，光合作用受限于CO2通过气孔的进入、其在叶肉组织中的扩散以及光合酶的生物化学活性。CO2的进入首先受到气孔导度的限制，而气孔导度受空气温度和湿度等环境条件调控。随后，CO2穿过叶片内部的气相和液相，最终到达Rubisco7。在C3植物中，光合作用的所有阶段均发生在叶肉细胞的叶绿体中，植物需要维持大气中的CO2持续不断地进入叶绿体。叶绿体中CO2的可利用性依赖于气孔开放程度、叶肉结构以及单个细胞和叶绿体的特性，这使得植物容易受到最终影响光合作用的环境限制因素的影响，例如水分供应不足和高温7,8,9,10，尤其凸显了其对气候变化条件的脆弱性11。

鉴于C3途径存在的效率低下问题，以及在维持最佳CO2浓度方面的能力有限且易受环境因素影响，某些植物进化出了另一种途径，即C4光合作用途径。典型地，C4植物具有两个在空间上分离的生化途径；初始的CO2固定发生在叶肉细胞中，由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEP羧化酶）催化，该酶对CO2的亲和力高于Rubisco，且不具有加氧活性。所形成的C4产物进一步被转运至维管束鞘细胞，在其中脱羧释放出CO2，再由Rubisco固定（即C3光合作用）12,13,14。PEP羧化酶对CO2的高亲和力以及维管束鞘细胞较厚的细胞壁，使得维管束鞘细胞内CO2得以浓缩，从而C4植物通过在空间上分隔CO2固定与卡尔文循环来最小化光呼吸作用。C4途径的采用体现了自然界对环境限制的适应性响应，为提升作物在气候变化条件下的生产力与抗逆性提供了潜在策略的启示15。

C4植物叶片结构的特化解剖特征表现为：维管束周围被含有叶绿体的增大的维管束鞘细胞所包围，并且叶肉细胞呈辐射状排列，形成围绕维管束鞘细胞的外环结构。叶肉细胞与维管束鞘细胞紧密相邻，使得两种细胞之间能够快速而持续地转运代谢物。这种细胞排列方式是C4植物的典型特征，被称为花环结构（Kranz anatomy）16。在C3植物中，叶肉细胞的特化和排列方式可能有所不同，但其维管束鞘细胞明显更小，且仅含有少量叶绿体或完全不含叶绿体。特化的花环结构可使CO2在维管束鞘细胞的叶绿体中富集，而此处正是C3羧化酶Rubisco的所在位置，从而有效抑制光呼吸4, 17, 18。尽管这种结构看似复杂，但在被子植物的进化过程中，此类结构已独立出现了多次，表明这是一条相对可行的进化路径19,20,21。已有研究表明，多个分类群正处于C3与C4碳代谢之间的中间阶段，被称为C3-C4或C2类型，具备浓缩和再同化CO2的能力22,23,24,25。

许多 C4 植物是具有重要经济价值的作物，近几十年来，通过基因工程改造水稻等 C3 作物以提高其对气候变化的适应能力并保障产量，已成为研究热点26,27。然而，这些基因工程工作的推进需要对 C4 植物特有的解剖结构及其对光合作用的调控机制有深入的理解2,28。

建立C4型花环结构是实现将C4光合作用引入C3作物这一宏伟目标的前提条件25。然而，目前对花环结构发育调控机制的理解仍有限，且缺乏快速筛选其关键解剖特征的方法，这使得杂交物种的鉴定变得困难。先前的研究表明，调控C3和C4植物光合效率的关键特征包括叶脉间距离、维管束鞘复合体的直径以及维管束鞘细胞的大小14,29。这些特征可通过徒手切片进行快速筛选，并利用半薄切片进行定量分析。本文描述了一种通过徒手横切片和光学显微镜评估C3与C4解剖学差异诊断特征的方法，具体包括维管束鞘面积、叶脉间距离和叶脉频率。

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方案

1. 植物生长条件

  1. 选择小麦（Triticum aestivum L. 变种 冬小麦 "弗雷迪斯"）和玉米（玉米（Zea mays） L. var. saccharata "金黄矮秆玉米"）作为代表性 C3 和 C4 分别种植这两种植物。将两种植物的种子置于环境可控的生长室中进行培养。
  2. 将相对湿度维持在55%，气温控制为25 °C/18 °C（昼/夜），光照周期为12小时。植物表面的光合光子通量密度（Q）维持在1200 µmol/m²/s。2/s 以模拟其自然生长条件。所有植物均在环境温度下培养，CO2 400 µmol/mol 的浓度
  3. 每2天给植物浇水一次nd 用蒸馏水浇灌，并在幼苗出土10天后施用霍格兰营养液。在指定条件下培养植物60天，取完全展开的叶片用于显微分析。

2. 徒手切片的制备与观察

  1. 从每株植物中选取3片成熟且未衰老的叶片，并将其保存在蒸馏水中。使用新的单面剃须刀片，进行一次水平切割，使切面与叶片表面呈直角，以确保获得垂直于叶片表面的横切面。
  2. 将叶片样本置于涂有牙科蜡的玻璃板上，以固定样品并防止滑动。切割时将刀片垂直向下移动，干净地穿过细胞。将所得横切片保存在蒸馏水中。
  3. 将样本置于载玻片上，先在载玻片上滴加一滴水，将切片放入水滴中，再盖上盖玻片，用于显微观察和成像。注意避免产生气泡。
  4. 在复式光学显微镜下以10倍和20倍放大倍数观察玻片。根据软件操作指南保存图像，并同时记录相应的标尺。

3. 半薄切片的制备

  1. 在玻璃板上，从玉米（Z. mays）和小麦（T. aestivum）叶片的中脉两侧叶间区域切取约 3 mm × 5 mm 大小的组织片段，操作方式同步骤 2.2。确保切取片段的长度方向与叶片纹理方向一致。
  2. 将植物材料放入注射器中，加入 1 mL 固定液（4% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸缓冲液，pH = 6.9，表 1）。
  3. 将注射器垂直放置，排出空气后用手指堵住尖端，抽动活塞以产生真空。重复此操作，直至样品沉入注射器底部，表明固定液已充分渗透。
  4. 将注射器内容物转移至已标记的玻璃小瓶中，在 4 °C 下保存 48 小时，再进行下一步操作（表 2）。
  5. 对于每个小瓶，用移液器小心吸除固定液，加入磷酸缓冲液至完全覆盖样品，静置 30 分钟。重复此步骤 3 次。
  6. 用移液器吸除磷酸缓冲液，加入四氧化锇（注意：有剧毒），直至完全覆盖样品。样品及其他有机物将变为黑色。操作时需佩戴双层手套。静置 1 小时。
  7. 用移液器吸除上一步溶液，用蒸馏水覆盖样品，静置 30 分钟。重复此步骤 3 次，每次均需佩戴双层手套。
  8. 用移液器吸除上一步溶液，用 50/50 蒸馏水-乙醇溶液覆盖样品，静置 30 分钟。随后依次使用以下比例的蒸馏水-乙醇溶液重复该步骤：30/70、20/80、10/90，最后用 100% 乙醇处理 2 次。上述任一溶液中的样品均可在 4 °C 下过夜保存。
  9. 用移液器吸除上一步溶液，用 1/3 树脂-乙醇溶液覆盖样品，将样品置于混匀仪上，静置 2 小时。随后依次使用以下比例的树脂-乙醇溶液重复该步骤：1/2、1/1、2/1、3/1，最后用 100% 树脂处理 2 次。 上述任一溶液中的样品均可在 4 °C 下过夜保存。
  10. 用 100% 树脂覆盖平底包埋模具的凹槽（16 个凹槽，每个凹槽尺寸：14 长 × 4.8 宽 × 3 深（mm）），将样品放置于凹槽一端。为每个样品准备手写纸标签，并将其置于凹槽另一端。
  11. 用 100% 树脂完全填满所有凹槽，若样品或标签发生移位应将其摆正。用包埋膜覆盖模具，并按照丙烯酸树脂产品说明在烘箱中进行聚合。
  12. 将含有样品的聚合块安装至超薄切片机的样品夹头上。使用粗制玻璃刀修块，直至组织可见并去除多余树脂。
  13. 使用玻璃刀或金刚石刀横向切割半薄切片（厚度 1 µm）。用金属接种环从水面上捞取切片，转移至载玻片上。将载玻片置于加热板（60 °C）上烘干，使切片牢固附着于玻片。
  14. 用甲苯胺蓝（1% 水溶液）对固定后的切片染色 5 秒，随后用蒸馏水冲洗，并再次在加热板上烘干。
    注意：化学固定过程必须在通风橱中进行。玻璃刀应定期更换，以确保切口锋利，获得无撕裂或变形的切片。

4. 样品成像

  1. 新鲜叶片切片的成像
    1. 根据说明书设置配备相应软件的复合光学显微镜。
    2. 将玻片放置在载物台上。调节目镜，先用10倍物镜观察切片以获得整体视野，然后依次使用20倍和40倍物镜进行观察。
    3. 在每个物镜下，切换至实时成像通道，聚焦于目标区域，并定位维管束周围鞘细胞。
    4. 聚焦完成后，点击冻结按钮，并在“工具”选项卡中点击比例尺按钮添加比例尺。将图像保存为.TIF格式，用于后续图像分析。
  2. 树脂浸渗切片的成像
    1. 将自动光学显微镜与计算机上的配套软件连接并进行设置。
    2. 加载透明通道，将玻片置于显微镜载物台上。使用40倍物镜放大倍率对切片进行聚焦，并调节亮度，确保所有细胞结构均清晰可见。
    3. 使用导航功能设定切片的成像区域，确保整个切片被完整成像，然后点击拼接按钮。
    4. 点击完成，然后点击开始，使显微镜自动完成整个切片的成像。打开图像分析软件，导入显微镜拍摄的图像瓦片。
    5. 使用“对齐”功能，确保各图像瓦片之间无重叠。生成图像后，通过“调整”选项卡校正位置、亮度和旋转角度。
    6. 在保存为.TIF格式前，将比例尺打印在图像上。
  3. 使用ImageJ软件进行解剖学测量
    1. 打开ImageJ软件，通过将图像拖入窗口的方式加载图像。
    2. 使用直线工具按以下步骤校准比例尺：在图像的比例尺上绘制一条直线，选择分析 > 设置比例尺，将“已知距离”设置为比例尺的实际长度，并将长度单位更改为正确的单位。
    3. 选择直线工具，在目标区域上划线，然后按M键，测量所需性状。
    4. 对于面积测量，选择多边形选区工具，围绕目标组织绘制轮廓，最后按M键结束。测量结果将以弹出窗口形式显示，可复制到电子表格中进行进一步数据分析。

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结果

图1A展示了叶片切片的正确取向，适用于新鲜切片和光学显微镜观察。使用单面刀片和牙科蜡板切割新鲜切片的方法见图1B。所得切片如图1C所示。

图2展示了C3植物T. aestivum和C4植物Z. mays代表性叶片的徒手切片。维管束鞘细胞在叶脉周围清晰可见，其中玉米的细胞更圆且颜色更绿，表明其叶绿体含量更高。通过这些图像可以测量叶片厚度和维管束鞘的总面积；然而，该方法无法对叶肉组织进行进一步表征。

图3展示了T. aestivum和Z. mays的半薄横切面。通过该方法，叶片的所有组织均清晰可见且可测量。Z. m...

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讨论

本文讨论了测量叶片解剖结构的定量与定性方法，以及这些方法的优化途径。此外，本研究方法还应用于代表性作物物种，以确定哪些解剖特征在区分C3和C4横切面时最为有效。理解这些特征至关重要，因为被称为C2光合作用的杂交类型正成为更具前景的研究方向。截至目前，仅有一种作物物种Diplotaxis tenuifolia（芝麻菜）被确认具有C2光合作用，但实际存在的种类可能多于现有记录25。C2类群内部表现出较高的种内光合多样性与可塑性，这意味着确认C2光合作用的存在需要多方面的证据支持，例如CO2补偿点测定、超微结构分析以及免疫组织化学技术30。

徒手切片和半薄切片已用于鉴定和测量特定植物组织多年，但本文旨在讨论其在解剖学叶片结构中的特定应用，这些结构影响 C3 和 C4 作物植物之间的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢欧盟H2020计划（项目GAIN4CROPS，资助编号862087）。卓越中心AgroCropFuture——未来气候下的农业生态与新型作物，由爱沙尼亚教育与研究部资助。我们感谢Evelin Loit-Harro教授提供普通小麦（T. aestivum）和玉米（Z. mays）种子，感谢Paula Palmet和Vaiko Vainola在制备叶片横切面过程中提供的帮助，以及João Paulo de Silva Souza在分析工作中的协助。所有图像均来自爱沙尼亚生命科学大学显微技术平台在不同项目中获得的结果。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二水合磷酸氢二钠（Na2高倍物镜42H2O) 纯PENTA, CZ10028-24-7
包埋膜，7.8 mil 厚，8 x 12.5（203 x 318 mm）ACLAR，美国10501-10
乙醇，abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000危险：高度易燃的液体和蒸气。
EVOS Invitrogen FL Auto 2 成像系统Thermo Fisher Scientific，美国
带金属框的16孔平嵌聚四氟乙烯模具PELCO，美国10501
2 ml 玻璃小瓶VWR生命科学，美国548-0045
戊二醛 50% 溶液VWR Life Science，美国23H2856331危险：吸入致命。吞咽有毒。造成严重皮肤灼伤和眼睛损伤。可能引起呼吸道刺激。佩戴防护手套、防护服、眼面部防护装备。
Histo金刚石刀Diatome, 美国
LEICA EM UC7Leica 维也纳，奥地利
LR White树脂硬质型号Electron Microscopy Sciences，美国14383危险：引起皮肤刺激。引起严重眼刺激。可能引起呼吸道刺激。可能引起困倦或头晕。佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护。
显微镜载玻片Normax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 和 Nikon DS-Fi1 5 MP尼康公司，日本
四氧化锇（OsO₄）4)Agar Scientific Ltd, GBR1019危险：吞咽、皮肤接触或吸入会致命。造成严重皮肤灼伤和眼睛损伤。佩戴双层防护手套、防护服及眼睛和面部防护装备。
移液器和移液器吸头赛默飞世尔科技，FIKJ16047
磷酸二氢钠二水合物（NaH2PO4 . 2H2O) 纯PENTA, CZ13472-35-0
10 ml 注射器Ecoject, DE20010
甲苯胺蓝，通用级Fisher Scientific，英国2045836

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