本文介绍了通过使用针对鸡GSDME的N端片段（chGSDME-NT）和碘化丙啶（PI）的抗体进行双重染色后，利用流式细胞术鉴定发生焦亡的细胞。
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本文内容
摘要
摘要
焦亡是一种由炎性介导的程序性细胞死亡，主要由Gasdermin（GSDM）家族蛋白经切割后产生的N端片段在细胞膜上形成孔道所驱动。通过Western Blot检测膜结合型GSDM-NT是评估焦亡最常用的方法。然而，该方法难以区分发生焦亡的细胞与其他形式的细胞死亡。在本研究中，采用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染的DF-1细胞作为模型，利用针对鸡GSDME N端片段（chGSDME-NT）的特异性抗体结合碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术定量分析发生焦亡的细胞比例。使用Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT抗体，可通过流式细胞术清晰检测到chGSDME-NT阳性的细胞。此外，IBDV感染细胞中chGSDME-NT/PI双阳性细胞的比例（约33%）显著高于模拟感染对照组（P < 0.001）。这些结果表明，通过流式细胞术检测膜结合型chGSDME-NT是鉴定细胞死亡过程中焦亡细胞的有效方法。
引言
焦亡是一种炎症性的程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中Gasdermin（GSDM）D在细胞膜上形成孔道1,2,3。由于鸡缺乏GSDMD基因4,5，鸡体内焦亡的机制仍不清楚。Gasdermin家族包含一系列保守蛋白，如GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB593,6。已有研究报道，来自硬骨鱼类和鸭子的GSDME可被caspase-1/3/7或caspase-3/7切割，从而诱导焦亡性细胞死亡7,8。然而，GSDME介导的焦亡在鸡抵抗病原体感染的宿主反应中的作用仍有待阐明。
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方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 样品细胞的制备
- 在六孔板中培养DF-1（永生化鸡胚成纤维细胞）细胞（每孔5 × 105个细胞），使用添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于38 °C、5% CO2培养箱中培养。
- 当细胞融合度达到80%时，弃去含血清的细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，然后每孔加入2 mL无血清细胞培养基。
- 向每孔加入IBDV病毒液（含计算好的MOI），设置模拟感染对照组，加入与病毒液体积相等的DMEM培养基。
- 病毒吸附1小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞三次，每孔加入2 mL添加2% FBS的DMEM，继续培养24小时。
- IBDV感染后24小时，进行胰蛋白酶处理（每孔500 µL，1分钟），随后用含10% FBS的DMEM（每孔2 mL）中和。之后收集细胞，制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。
- 在2–8 °C条件下，以400 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。
- 用PBS重悬细胞沉淀，并轻轻涡旋振荡管子3秒。
- 按照步骤1.6所述条件（400 × g，2–8 °C，离心5分钟）再次离心细胞。
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结果
chGSDME-NT 在IBDV感染的DF-1细胞膜上可 readily 通过流式细胞术检测到
细胞焦亡最重要的特征之一是GSDM介导的细胞膜孔道形成NT 由Gasdermin切割产生的片段。因此，理论上可通过流式细胞术检测焦亡细胞 通过 检测GSDM-NT 使用特异性抗体检测细胞膜上的变化。因此，用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染DF-1细胞，并通过流式细胞术检测焦亡细胞，所用抗体为Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME抗体。NT McAb 和 PI 染色。有相当数量的 chGSDME-NT 感染IBDV后通过流式细胞术检测到阳性细胞（图1）。相比之下，模拟感染的对照组或使用同型对照IgG染色的细胞中，Alexa Fluor 647阳性细胞极少。这些结果表明，膜结合型chGSDME可被有效且特异性地检测到NT 通过流式细胞术。值得注意的是，裂解后的chGSDME的C端片段（.......
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讨论
本文介绍了一种利用流式细胞术检测焦亡的有效方法，该方法通过对感染细胞进行Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT 单克隆抗体与PI的双重染色实现。该方法还可应用于多种细胞类型，以区分焦亡与其他类型的细胞死亡，如凋亡和坏死。
焦亡，一种炎症性程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中由GSDMD介导的细胞膜孔道形成1,2,3，传统上通过LDH释放等方法进行评估6,15，形态特征16，以及 GSDM- 的检测NT/GSDM-计算机断层扫描 片段 通过 Western Blot 或 IFA 检测17.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢刘珏博士的大力协助。本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFD1800300）、国家自然科学基金（编号：32130105）以及现代农业产业技术体系专项资金（编号：CARS-40）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 圆底聚苯乙烯管（12 × 75 毫米 | Corning Falcon | 352052 | |
| 6孔细胞培养板 | 康宁 | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A20186 | |
| 抗chGSDME-CT单克隆抗体 | 中国中山 SAE 生物医学技术公司 | EU0228 | |
| 抗chGSDME-NT单克隆抗体 | 中国中山SAE生物医学技术有限公司 | EU0227 | |
| CellQuest 软件 | BD 生物科学 | ||
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 3100 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco（隶属于 Life Technologies） | C11995500BT | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学 | FACSCalibur | |
| 流式细胞术染色缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 00-4222-26 | |
| 血细胞计数板 | 邱井生化试剂 &安普&仪器公司（中国上海） | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx 毒株 | IBDV Lx 毒株由位于中国北京的北京市农林科学院刘珏博士惠赠 | ||
| 倒置显微镜 | 重庆光电仪器公司 | XDS-1B | |
| 正常小鼠 IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | M&和C 基因技术 | CC017 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | M&与 基因技术 | CC008 | |
| 涡旋振荡器 | MIULAB | MIX-28+ |
参考文献
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Na....
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