L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.
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Articolo metodologico
Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) sono fondamentali per il corretto funzionamento della retina. La disfunzione dell'RPE è coinvolta nella patogenesi di importanti malattie della retina, come la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la retinopatia diabetica. Presentiamo un approccio semplificato per l'isolamento dell'RPE dagli occhi adulti murina. A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio consente l'isolamento e la coltura di RPE altamente puro da topi adulti. Questo metodo semplice e veloce non richiede grandi competenze tecniche ed è realizzabile con strumenti scientifici e reagenti di base. Gli RPE primari sono isolati da topi di fondo C57BL/6 di età compresa tra 3 e 14 settimane mediante enucleazione dell'occhio seguita dalla rimozione del segmento anteriore. La tripsinizzazione enzimatica e la centrifugazione vengono utilizzate per dissociare e isolare l'RPE dall'oculare. In conclusione, questo approccio offre un protocollo rapido ed efficace per l'utilizzo dell'RPE nello studio della funzione e della malattia retinica.
Introduzione
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato cellulare specializzato che riveste la membrana di Bruch, situata tra i fotorecettori e la coroide1. Le cellule RPE svolgono un ruolo fondamentale nel corretto funzionamento della retina. Le cellule RPE trasportano il glucosio e la vitamina A ai fotorecettori, promuovono la visione mediante la reisomerizzazione di all-trans retinal in 11-cis retinal e mantengono i segmenti esterni del fotorecettore attraverso la fagocitosi dei segmenti esterni eliminati, rimuovono l'acqua dallo spazio sottoretinico, formano la barriera emato-retinica esterna attraverso la presenza di giunzioni strette e secer....
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Protocollo
L'uso di soggetti animali in questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Case Western Reserve University.
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare il mezzo tampone di lavaggio integrando la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo con 10 mM di soluzione tampone HEPES. Conservare la soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare il terreno RPE integrando il Medium Eagle's Modified di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio, 1,25x GlutaMAX Supplement (concentrazione madre 100x o 200 mM; concentrazione finale....
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Risultati
Il protocollo descritto è stato utilizzato su topi di fondo C57BL/6. Il genere non sembra cambiare la capacità di coltivare l'EPR. I topi con meno di 6 settimane producono fogli di RPE limitati rispetto ai topi più anziani e potrebbero essere necessari più occhi per raggiungere la confluenza ottimale. Dopo l'isolamento, le cellule RPE impiegano circa 3 giorni per stabilizzarsi e attaccarsi alla piastra di coltura cellulare. Circa 24 ore dopo l'isolamento, le cellule rotonde e pigmentate che sembrano anucleate hanno inizi.......
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Discussione
In questo articolo, abbiamo delineato un protocollo semplificato per l'isolamento e la coltura dell'epitelio pigmentato retinico murino. Le cellule RPE isolate dagli occhi di topi adulti esprimevano un marcatore specifico per RPE, RPE65, e un marcatore di giunzione intercellulare, ZO-1. Inoltre, le cellule coltivate si sono sviluppate in fogli esagonali pigmentati in coltura.
Diversi metodi per l'isolamento dell'RPE nei roditori sono stati pubblicati in precedenza<.......
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Dichiarazioni
Non ci sono informazioni finanziarie o non finanziarie rilevanti.
Ringraziamenti
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata da NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) e P30 EY011373. L'organizzazione finanziatrice non ha avuto alcun ruolo nella progettazione o nella conduzione di questa ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,009 RD Lame a taglio singolo | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio |
| Siero fetale bovino | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hank | Gibco | 14175095 | senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo |
| Soluzione tampone HEPES (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Micro-Unitome Coltello | BVI Beaver | 377546 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Falcon | 08-772-1 | 24 o 48 pozzetti | |
| Corning | 35-010-CV | ||
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | con forbici Vannas rosso fenolo |
| Strumenti di scienza | 10091-12 |
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M.
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Ristampe e permessi
