Identifiering av sällsynta antigenspecifika T-celler från muslungor med peptid: Tetramerer av histokompatibilitetskomplex
Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att isolera och identifiera sällsynta antigenspecifika T-cellspopulationer i muslungor genom magnetisk pärlbaserad T-cellsberikning och tetramerer av peptid:major histocompatibility complex (MHC).
Abstract
Identifiering och karakterisering av antigenspecifika T-celler under hälsa och sjukdom är fortfarande en nyckel till att förbättra vår förståelse av immunpatofysiologi. De tekniska utmaningarna med att spåra antigenspecifika T-cellspopulationer inom den endogena T-cellsrepertoaren har utvecklats kraftigt genom utvecklingen av peptid:MHC-tetramerreagenser. Dessa fluorescerande märkta lösliga multimerer av MHC klass I eller klass II-molekyler komplexerade till antigena peptidepitoper binder direkt till T-celler med motsvarande T-cellsreceptorspecificitet (TCR) och kan därför identifiera antigenspecifika T-cellspopulationer i deras ursprungliga tillstånd utan krav på ett funktionellt svar inducerat av ex vivo stimulering. För ytterst sällsynta populationer kan tetramerbundna T-celler anrikas magnetiskt för att öka känsligheten och tillförlitligheten i detektionen.
I takt med att undersökningen av vävnadsresidenta T-cellsimmunitet fördjupas, finns det ett akut behov av att identifiera antigenspecifika T-celler som trafikerar till och finns i icke-lymfoida vävnader. I detta protokoll presenterar vi en detaljerad uppsättning instruktioner för isolering och karakterisering av antigenspecifika T-celler som finns i muslungor. Detta innebär isolering av T-celler från smält lungvävnad följt av ett allmänt T-cellsmagnetiskt anrikningssteg och tetramerfärgning för analys och sortering av flödescytometri. Stegen som beskrivs i detta protokoll använder vanliga tekniker och lättillgängliga reagenser, vilket gör det tillgängligt för nästan alla forskare som är engagerade i mus-T-cellsimmunologi, och är mycket anpassningsbara för en mängd olika nedströmsanalyser av alla lågfrekventa antigenspecifika T-cellspopulationer som finns i lungorna.
Introduction
Kärnan i det adaptiva immunsystemet ligger T-cellens förmåga att känna igen och reagera på ett specifikt antigen. När och var en T-cell reagerar på sitt besläktade antigen bestämmer balansen mellan infektion och autoimmunitet, homeostas och cancer, hälsa och sjukdom1. Av detta följer att studier av T-celler i ett specifikt sammanhang av immunitet bör fokusera på de celler som är specifika för ett relevant antigen av intresse. Bland de tekniska framsteg som kraftigt har förbättrat förmågan att karakterisera antigenspecifika T-cellspopulationer är fluorescerande märkta lösliga multimerer (vanligtvis tetramerer) av major histocompatibility complex (MHC) klass I eller klass II-molekyler komplexa till antigena peptidepitoper, mer kända som “peptid:MHC-tetramerer”2,3,4,5 . Genom att representera de naturliga liganderna av T-cellsantigenreceptorer (TCR) ger peptid:MHC klass I och klass II-tetramerer ett sätt att direkt identifiera antigenspecifika CD8+ respektive CD4+ T-celler inom den endogena repertoaren av T-celler i immunsystemet utan krav på svar på antigenstimulering i en analys. Tetramerer representerar ett mer elegant tillvägagångssätt för studier av antigenspecifika T-celler än TCR-transgena T-cellsadoptiva överföringsmodeller6, och har i allt högre grad använts för att identifiera främmande och självantigenspecifika T-cellspopulationer i både experimentella musmodeller och human sjukdom 4,5.
Medan tetramerer lätt kan identifiera högfrekventa populationer av T-celler som har expanderat som svar på antigenstimulering, begränsas deras användning för naiva, självantigenspecifika eller minnes-T-celler av de mycket låga frekvenserna hos dessa populationer7. Vår grupp och andra har utvecklat och populariserat tetramerbaserade magnetiska anrikningsstrategier som ökar detektionskänsligheten för att möjliggöra studier av dessa cellpopulationer i lymfoida vävnaderhos möss 8,9,10,11.
Framväxten av vävnadsresidenta T-celler i fält har lagt ökad tonvikt på att utveckla nya sätt att undersöka T-celler i det icke-lymfoida utrymmet. Liksom många andra slemhinnor möter T-celler i lungorna en rad egna och främmande antigener som härrör från värdepitel, kommensala och infektiösa mikrober och miljöenheter, inklusive allergener. Transkriptionsanalys av T-celler skördade från icke-lymfoid vävnad (NLT) visar en minnesliknande fenotyp som har ett unikt vävnadsspecifikt öde och funktion, ofta riktat mot trafficking och vävnadshomeostas12. Dessutom tenderar T-celler i vävnadsminnet (Trms) att vara mer klonalt begränsade än de som är i omlopp13. Att bestämma hur och varför antigener driver T-cellsvistelse i NLT är avgörande för att förstå hur immunsystemet skyddar mot infektion, upprätthåller vävnadshomeostas och ibland utvecklas till autoimmunitet. Det verkar dock finnas en större attrition bland vävnadsresidenta T-celler från lungorna jämfört med andra NLT14. Följaktligen är förmågan att identifiera och karakterisera endogena T-celler i lungan med en given antigenspecificitet begränsad av deras inneboende sällsynthet.
Genom att kombinera användningen av magnetiska pärlbaserade cellberikningstekniker och peptid:MHC-tetramerfärgning har vi lyckats detektera expanderade men sällsynta självantigenspecifika T-celler i muslungor15,16. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av ett protokoll som vi har optimerat för att på ett tillförlitligt sätt isolera och karakterisera alla sällsynta antigenspecifika T-cellspopulationer som finns i muslungor (Figur 1). Detta protokoll innehåller ett in vivo antikroppsfärgningssteg för att skilja vävnadsresidenta från vaskulära T-celler17 följt av två olika metoder för bearbetning av lungvävnad för att tillgodose resurstillgänglighet. Detta följs sedan av ett allmänt T-cellsmagnetiskt anrikningssteg, tetramerfärgning och analys med flödescytometri. Cellviabilitet och tetramerfärgning förbättras ytterligare i detta protokoll genom tillsats av aminoguanidin, som blockerar inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS)-medierat T-cellsaktiveringsinducerad apoptos18 och dasatinib som begränsar TCR-nedreglering19. Stegen som beskrivs i detta protokoll använder vanliga tekniker och lättillgängliga reagenser, vilket gör det tillgängligt för nästan alla forskare som är engagerade i mus-T-cellsimmunologi och är mycket anpassningsbart för en mängd olika nedströmsanalyser. Även om det inte är troligt att naiva T-celler finns i lungorna, tror vi att detta protokoll kommer att vara särskilt användbart för studier av självantigenspecifika T-celler och Trms i lungorna.
Bild 1: Översikt över protokollarbetsflödet. Lungor skördas från möss och dissocieras till enskilda celler. Proverna anrikas därefter för T-celler innan de färgas med peptid:MHC-tetramerer och fluorescerande märkta antikroppar för flödescytometrisk analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare karakteriseringar av antigenspecifika T-celler från lungorna har gynnats av det robusta antalet antigenspecifika T-celler som expanderar efter en akut priminghändelse såsom intranasal immunisering eller infektion 20,21,22. Emellertid är det svårt att upptäcka mer sällsynta T-cellspopulationer i lungorna, såsom självantigenspecifika T-celler eller vävnadsresidenta minnes-T-celler, utan någon form av provberikn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar L. Kuhn för teknisk hjälp med vävnadsbearbetning och tetramerproduktion. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (R01 AI107020 och P01 AI165072 till J.J.M., T32 AI007512 till D.S.S.), Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M.) och Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).
Materials
| 100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
| 1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
| AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
| CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
| Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
| Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
| Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
| gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
| Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
| Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
| RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
| Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
| Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
- Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4 + T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
- Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. 68, 4420 (2012).
- Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), eaas9673 (2019).
- Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
- Wakim, M. Z. M., Zheng, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
- Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
- Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839 (2023).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
- Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
- Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
- Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
- Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. 29, 1266 (2009).
- Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
- Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
- Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
- Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).
