我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。
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摘要
摘要
细胞静息是一种生长停滞或增殖减缓的状态，在正常干细胞和癌症干细胞（CSCs）中均有描述。静息状态可能使癌症干细胞免受抗增殖化疗药物的作用。在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中，静息细胞与治疗耐药性和干性相关。细胞增殖染料是追踪细胞分裂的常用工具。荧光染料共价结合到细胞膜及胞内大分子上的氨基基团，从而实现对标记细胞最多达10次分裂的追踪，可通过流式细胞术分辨。
最终，增殖速率最高的细胞会表现出较低的染料保留，因为染料在每次细胞分裂后都会被稀释，而处于静息状态或分裂较慢的细胞则会保留最多的染料。利用细胞增殖染料分离静息细胞的方法已在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）小鼠模型中得到优化和描述。作为现有小鼠模型的补充，源自rag2:Myc的斑马鱼T-ALL模型为研究T-ALL中自我更新能力提供了理想平台，这得益于其白血病干细胞（LSCs）的高频率以及斑马鱼在大规模移植实验中的操作便利性。
此处，我们描述了使用细胞增殖染料对斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞进行染色的工作流程，优化了该染料在斑马鱼细胞中的使用浓度，并成功传代了染色后的细胞 体内，以及通过移植动物的活细胞分选收集具有不同染料滞留水平的细胞。鉴于目前尚无明确的T-ALL中白血病干细胞（LSCs）细胞表面标志物，该方法为研究静息细胞提供了功能性手段 体内对于代表性结果，我们描述了高染料滞留细胞和低染料滞留细胞的移植效率及白血病干细胞频率。该方法有助于进一步研究静息细胞的其他特性，包括药物反应、转录谱和形态学特征。
引言
成体干细胞负责特定器官中已分化细胞类型的再生，通常主要处于静息、不分裂的状态1,2。例如，维持血液系统的造血干细胞（HSCs）大部分时间保持静息状态，仅有极小部分进入细胞周期，进行自我更新或分化以产生成熟的血细胞成分3。类似地，在癌症中，存在一类稀少的细胞亚群，称为肿瘤干细胞（CSCs），具有自我更新能力，并负责恶性肿瘤的长期维持4。肿瘤干细胞在体内（in vivo）通常处于静息或缓慢增殖状态，这种特性可能使其逃避抗增殖类癌症治疗5，逃避免疫系统的清除6，降低氧化应激，并增强其DNA修复通路7。即使治疗后残留极少量的肿瘤干细胞，也可能重新填充肿瘤，导致患者复发8。因此，深入理解细胞静息机制，对于发现肿瘤干细胞的潜在弱点以及开发新的靶向治疗策略具有重要意义。
细胞增殖染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料及其衍生物）常用于追踪细胞分裂频率9。该染料可穿透细胞膜，进入细胞后被细胞内酯酶激活，生成荧光产物。生成....
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方案
在本实验方案中，我们使用先前在CG1品系中构建的GFP标记的斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞，这些细胞可直接注射到同基因型的CG1斑马鱼受体中15。简言之，通过将rag2:Myc和rag2:GFP质粒DNA显微注射至单细胞期的CG1斑马鱼胚胎中以诱导白血病。注射后3周起，利用荧光显微镜监测动物白血病的发生情况。通过流式细胞分选（FACS）分离GFP阳性的白血病细胞，并将其连续移植到CG1斑马鱼受体中，以获得具有较高白血病干细胞（LSC）频率的克隆。该完整实验方案的详细信息由Blackburn等人15描述。
此外，可通过DNA显微注射斑马鱼胚胎来产生原发性rag2:Myc来源的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）17。将rag2:Myc与一种由rag2启动子驱动的荧光报告基因（如GFP）共同进行DNA显微注射，可导致B细胞、T细胞以及混合型急性淋巴细胞白血病（ALL）的发生18。本实验方案中所使用的白血病克隆此前已确认为T-ALL15。所有涉及斑马鱼的实验操作均经肯塔基大学机构动物照护与使用委员会审查并批准（方案编号：2019-3399）。
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结果
我们采用上述方案对保留了细胞增殖染料CT-FR的细胞进行分选，并将其用于有限稀释分析（LDA），以估算CT-FR高表达和CT-FR低表达群体中白血病干细胞（LSC）的频率。为设定流式细胞术实验的门控参数，我们除使用单色对照外，还设置了无荧光染料（无颜色）对照(图2A)。这些象限用于确定FITC和PE阳性及阴性群体，以建立分选门控。CT-FR单色阳性对照于分选当天制备，通过染色未移植的野生型斑马鱼细胞获得，因此其信号强度预期显著高于样本中传代细胞的信号强度。
在CT-FR染色的GPF T-ALL中(图2B)，位于右上象限、频率较低（0.13%）的细胞被视为CT-FR高表达细胞，并在此象限设置标记为“CT-FR high”的分选门。另在右下象限设置一个分选门，用于收集CT-FR低表达的白血病细胞。由于肿瘤样本中CT-FR高表达细胞丰度.......
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讨论
已知肝窦内皮细胞对传统的抗增殖化疗具有耐药性，针对这些细胞开发靶向治疗策略在降低复发率和改善患者预后方面具有重要意义20既往研究描述了使用荧光细胞增殖染料鉴定T-ALL PDX模型中与耐药性和干性相关的一小群静息细胞13在本研究中，我们描述了使用一种类似的细胞增殖染料来分辨T-ALL斑马鱼模型中分裂缓慢或处于静息状态的细胞。我们利用该工具发现，具有最高染料滞留能力的细胞中富含白血病干细胞（LSCs）。将此类研究拓展至斑马鱼模型具有诸多优势。斑马鱼繁殖力强，每对交配个体每周可产生数百个子代，这为需要大量动物个体的移植实验和极限稀释分析提供了有力支持。15,17,21此外，斑马鱼非常便于 体内 成像，通过简单的荧光显微镜实现对阳性动物的快速筛选16因此，该方案可作为进一步研究斑马鱼T-ALL模型中.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国家癌症研究所（R37CA227656，授予JSB）提供资助。本研究还得到了肯塔基大学马基癌症中心流式细胞术与免疫监测共享资源（P30CA177558）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 26 G/2” 微量注射器 | Hamilton | 87930 | NA |
| 35 µm 滤帽式 FACS 管 | Falcon | 352235 | NA |
| 40 µm 细胞筛 | CELLTREAT | 229482 | NA |
| 96 孔带裙边 PCR 板 | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
| 细胞分选仪 | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
| CellTrace 远红外染料 | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
| 锥形管 | VWR | 10026-078 | NA |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Caisson Labs | 22110001 | NA |
| 落射荧光体视显微镜 | Nikon | SMZ25 | NA |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
| 鱼类养殖系统用水 | N/A | N/A | 0.03–0.05% 盐度，pH 6.5–8，碳酸氢钠缓冲 |
| 微量离心管 | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
| MS-222 | Pentaire | TRS-1 | 三卡因甲磺酸盐，一种麻醉剂 |
| 培养皿 | Corning | 07-202-011 | NA |
| 剃须刀片 | American Line | 66-0089 | NA |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |
参考文献
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell.
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重印与许可
