本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中进行的双光子激光消融方法，该模型可用于研究骨再生以及免疫反应对消融的影响。
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摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）具有极强的器官和附肢再生能力。目前已有多种方法用于研究斑马鱼的骨骼再生，包括鳍条截断、鳞片拔除、颅骨开窗以及显微操作技术。本研究采用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描系统，建立了一种激光消融方法，作为损伤模型，用于消融斑马鱼幼鱼发育中的鳃盖骨成骨细胞（osteoblasts）。该方法可实现对细胞的精确消融，消融区域的面积、形状和深度均可精细调节。此外，该方法可在消融前后对同一区域进行成像，从而能够分析损伤后的短期效应。在本实验体系中，研究了成骨细胞消融后损伤区域的免疫反应。结果显示，消融后巨噬细胞的募集显著增加，表明其在骨骼再生过程中具有重要作用。
引言
斑马鱼能够再生多种器官，例如视网膜、脑、心脏和胰腺1。此外，斑马鱼还能再生骨骼结构，因此被广泛用于研究鳍、鳞片和颅盖（头骨盖）的再生过程2。目前已有多种实验范式被用于研究组织和骨再生，包括鳍切除（截肢）、鳍骨折、颅骨钻孔3,4、冷冻损伤5,6以及基因靶向消融7,8,9。近年来，激光消融技术已在斑马鱼中被广泛应用于研究损伤后的愈合与再生反应10,11,12,13,14。
激光介导消融技术已应用于生物学研究的多个领域，如力学生物学、发育生物学、再生....
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方案
研究方案已获得萨克森州政府（Landesdirektion Sachsen）的批准，许可编号为25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87。所用斑马鱼品系的饲养均依照国家法律，并在标准化条件下进行，具体方法如前所述。27,28. 本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列于 材料表.
1. 材料与溶液的准备
- 将胚胎保存在 1x E3 培养基中。通过将 170 mL 的 60x E3 储存液加入 10 L 去离子水中稀释，并添加 2 mL 0.1% 亚甲蓝，配制 1x E3 培养基。
- 通过将 17.2 g NaCl、0.76 g KCl、2.90 g CaCl2·2 H2O 和 4.90 g MgSO4·7 H2O 溶解于 1 L 去离子灭菌水中，配制 60x E3 储存液。
- 为幼鱼包埋，预先分装低熔点琼脂糖（LMA）至 1% 浓度，并于室温保存。
- 分装时，将 LMA 溶解于 1x E3 培养基中，例如将 50....
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结果
激光消融操作按照上述方案进行。成骨细胞在消融区域内的GFP信号在消融后立即消失。为了研究成骨细胞消融后免疫反应的变化，对6 dpf幼鱼在消融前以及6 hpl时巨噬细胞的存在情况进行了成像观察。消融前，在鳃盖区域几乎观察不到巨噬细胞10（图2）。在6 hpl时，检测到消融的鳃盖区域出现巨噬细胞显著聚集，且视野中巨噬细胞数量增加，包括鳃盖及其周围区域10（图2）。
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讨论
激光消融已应用于生物研究的多个领域。特别是，它作为一种研究组织再生的方法非常有用10,11,12。例如，最近通过紫外激光或双光子激光消融实验，结合成骨细胞在激光消融位点的恢复情况，对先天免疫细胞的募集及其表型变化进行了动态分析10。活体成像可实现损伤后12小时（hpl）内的免疫细胞募集监测；然而，通过适当调整麻醉方案并获得相关机构批准，可设想更长时间的成像观察。在Geurtzen等人的研究中，分析持续至激光消融后数天，有助于明确消融部位的炎症微环境，并确立巨噬细胞在骨再生中的支持作用10。许多其他应用也可行，例如研究细胞死亡过程中活性氧物质 释放对骨组织的影响33 。
使用双光子激光介导细胞消融技术的一个优势在于，可将其与共聚焦成像相结合。此处使.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）跨区域合作项目 Transregio 67（项目编号 387653785）以及 DFG 优先计划 SPP 2084 µBone（项目编号 KN 1102/2-1）资助，资助对象为 FK。本工作还得到了德累斯顿工业大学 CMCB 技术平台核心设施——光学显微镜设施（DFG 项目编号 413875620）的支持。德累斯顿工业大学的研究工作由萨克森州议会（“Landtag”）批准预算中的税收收入共同资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二水合氯化钙，CaCl2·H2O | Carl Roth | 5239.1 | |
| 细胞培养皿，聚苯乙烯材质，100/20 mm | Greiner Bio-one | 664160 | |
| Dumont #55 镊子 | FST | 11295-51 | 尖端形状为直头，长度11 cm，尖端尺寸0.05 × 0.02 mm |
| Falcon 6孔板 | Corning | 353502 | |
| 玻璃底小培养皿 | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35 mm 培养皿，1.5号盖玻片，玻璃直径14 mm，未包被 |
| Insight X3 多光子激光器 | Spectra-Physics | ||
| Leica 应用套件 | LAS X，Leica Microsystems | ||
| 低熔点琼脂糖 | Biozyme | 840101 | Biozym Plaque Agarose |
| 七水合硫酸镁，MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M5921 | |
| 交配笼 | 多种型号，例如 Tecniplast | ||
| 亚甲蓝 | Carl Roth | A514.1 | |
| MS-222 | SIGMA Aldrich | A5040 | |
| 氯化钾，KCl | PanReac AppliChem | 131494 | |
| 氯化钠，NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| SP8 FALCON | Leica Microsystems | 配备 Insight X3 多光子激光器和 Leica 应用套件软件 | |
| 不锈钢解剖针 | Bochem | 12010 | 140 mm |
| 体视显微镜系统 SZX16 | Olympus | 配备 LED 照明底座 SZX2-ILLTQ | |
| 恒温培养箱 TS - WTW | xylem | TS 608/2-i | 用于胚胎培养 |
| 移液管，3.5 mL | SARSTEDT | 861171 | 155 × 15 mm，低密度聚乙烯材质，透明 |
| Zeiss SteREO Discovery.V12 版本 4.7.1.0. | Zeiss | 配备 Axiocam MRm 相机和 AxioVision 软件 |
参考文献
- Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
- Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
- Geurtzen, K., Knopf, F.
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重印与许可
