Summary
هذا الفيديو وبروتوكول لشرح كيفية زرع زجاج النافذة المغطاة الجمجمة لدى القوارض. ويمكن استخدام هذه المستحضرات لمزمنة في الجسم الحي two الفوتون التصوير من القشرة المخية الحديثة على جداول زمنية لأشهر. ويمكن أيضا استخدامه لأنواع أخرى من التصوير ، والتصوير الضوئي بما في ذلك إشارة جوهرية.
Abstract
تقنيات التصوير أصبحت ذات أهمية متزايدة في دراسة وظائف المخ. من بينها ، برز ثنائي الفوتون المجهري المسح بواسطة أشعة الليزر كطريقة مفيدة للغاية ، لأنه يسمح للدراسة الدماغ سليمة حية. مع الاستعدادات المناسبة ، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة المنطقة القشرية نفس مزمنة ، من دقائق إلى أشهر. في هذا الفيديو ، نظهر استعدادا لتصوير المزمن في الجسم الحي من الدماغ باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. كان في البداية هذه التقنية التي بدأها الدكتور كاريل سفوبودا ، وهو الآن في معهد هوارد هيوز الطبي محقق في مزرعة Janelia. ويمكن استخدام مستحضرات مثل واحد هو موضح هنا لتصوير هيكل القشرة المخية الحديثة (على سبيل المثال ، وديناميات الشجيرية ومحواري) ، لتسجيل نشاط الخلايا العصبية باستخدام الكالسيوم الحساسة الأصباغ ، لالقشرية صورة ديناميكية تدفق الدم ، أو للدراسات الذاتية التصوير الضوئي. التصوير العميق للاللحاء الجديد هو ممكن مع أفضل إطار عملية جراحية في الجمجمة. تعمل في ظل ظروف بالغة العقيمة من الممكن تجنب الإصابة بالأمراض ، جنبا إلى جنب مع استخدام العناية القصوى للا تضر الأم الجافية أثناء الجراحة ، سوف يؤدي إلى النوافذ الزجاجية المغطاة ناجحة وطويلة الأمد في الجمجمة.
Protocol
- تخدير الفئران مع isoflurane (4 ٪ لتحريض ، 1،5-2 ٪ للجراحة) باستخدام IACUC الإجراءات المعتمدة. من المهم أن تستخدم الذيل و / أو يقرص اصبع القدم من أجل ضمان مخدرا تماما الحيوانية.
- باستخدام الانتهازي القوارض ، وحلق الشعر من الجزء الخلفي من الرقبة حتى العينين.
- ضع الماوس في إطار التجسيمي ، على مدى بطانية جراحة إعادة تدوير المياه. آمن بقوة الرأس بقضبان الأذن.
- تطبيق مرهم العين ، من أجل منع العين الحيوان من الجفاف.
- إدارة ، تحت الجلد ، ديكساميتازون (0.2 ملغ / كلغ) ، وكاربروفين (5 ملغ / كلغ) لمنع تورم في الدماغ و / أو الاستجابة الالتهابية ، على التوالي.
- قبل البدء في الجراحة ، وتعقيم المنطقة التي تعمل بواسطة المسح الجلد مع ثلاثة الضربات الشديدة بالتناوب من الكحول 70 ٪ وbetadine.
- تم الانتهاء من جميع الأدوات الجراحية قبل تعقيمها باستخدام حبة تعقيم الزجاج. باستخدام مقص التي تم تعقيمها مع الإيثانول ، إزالة الجلد فوق الجزء العلوي من الجمجمة ، بدءا من قطع أفقي على طول قاعدة الرأس ، تليها اثنين من التخفيضات في الاتجاه منقاري ، ليصل إلى ما يقرب من الجفون ، ثم اثنين من التخفيضات المائل التي تلتقي في خط الوسط.
- يتم تطبيق قطرة من محلول يدوكائين الإيبينيفرين + في هذه المرحلة على السمحاق لتجنب النزيف أو الألم. مع مشرط ، سحب السمحاق على حواف الجمجمة. أيضا ، يتراجع قليلا في الجهاز العضلي من الجزء الخلفي من الرقبة.
- كشط بلطف على المنطقة بأكملها معرضة للجمجمة مع مشرط لخلق سطح جاف. هذا مهم جدا ، لأنها سوف تسمح للالغراء التمسك أفضل عند تطبيقها في وقت لاحق.
- مرة واحدة وقد تم اختياره في موقع التصوير ، واحد هو على استعداد لإنشاء إطار الجمجمة. أولا ، بلطف "لرسم" حلقة من حوالي 4 مم وقطرها مع التدريبات الهوائية الأسنان.
- بعد حفر طفيفة ، وتطبيق حل الإيبينيفرين يدوكائين + مرة أخرى على سطح الجمجمة. وقف الحفر عند ترك طبقة رقيقة جدا من العظام. بالضغط بلطف على مركز حج القحف أن يشعر كيف أنها تعطي الطريقة ، يمكن للمرء أن يعرف عادة أن يتم التوصل إلى هذه المرحلة.
- تحت قطرة من المياه المالحة والاستفادة من اتخاذ ترابيق العظم -- هيكل الاسفنجية للعظم -- رفع حج القحف بعيدا من الجمجمة مع ملقط تلميح رقيقة جدا. والمالحة هو المهم ، لأنها سوف تساعد في رفع تصل الجمجمة ونزيف في منع الجافية.
- تطبيق جلفوم التي تم نقعها في المياه المالحة في السابق لجافية لإيقاف أي نزيف يحدث أحيانا أن صغيرة عند إزالة الجمجمة.
- بعد تجفيف سطح جافية ، وضمان عدم وجود نزيف ، تكمن برفق زجاج معقمة 5 مم زلة تغطية على رأس الأم الجافية. (ملاحظة : المجموعات الأخرى أيضا وضع قطرة من انخفاض درجة انصهار agarose (1.2 ٪) خلال الجافية ووضع على رأس ساترة للآجار).
- تطبيق قطرة cyanocrylate مقرها الغراء لنصف الكرة المعاكس على الجمجمة. مع مساعدة من إبرة ، وتطبيق برفق الغراء في جميع أنحاء نافذة مع الحرص على عدم وضعه تحت الزجاج. ويمكن الآن الغراء تطبق في طبقة رقيقة فوق سطح الأرض كله من الجمجمة.
- بمجرد أن يجف الغراء ، مزيج من الاكريليك الأسنان وتطبيقه في جميع أنحاء سطح الجمجمة ، وتغطي أيضا حافة صغيرة من زلة تغطية ، لضمان الحصول عليها.
- بعد الحصول على تغطية زلة ، وجعل بئر صغيرة حول الإطار مع الاكريليك الأسنان. أيضا ، تضمين شريط التيتانيوم في الاكريليك الأسنان. سيتم لاحقا هذا الشريط أن تستخدم لتوصيل الماوس بأمان إلى مرحلة من مراحل المجهر للتصوير. فمن المهم لضمان أن شريط غير مستوى ، بحيث يسير بشكل متواز مع النافذة في الجمجمة. ويمكن وضع قطعة من الورق تحت شريط يسمح للشريط على البقاء في حين أن مستوى الاكريليك يصلب.
- ولا يسمح للالاكريليك لعلاج الأسنان (تصلب) لمدة 10 دقيقة ، وهو الوقت الذي يتم إصلاح شريط التيتانيوم في المكان. وضع الحيوانات في قفص الدافئة حتى يتعافى.
- بعد التعافي من التخدير ، ويمكن تصوير الحيوان في نفس اليوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما بينا في شريط الفيديو والتكميلية في الأرقام ، وإعداد إطار الجمجمة ، جنبا إلى جنب مع استخدام اثنين من الفوتون المجهري ، هو أداة قوية جدا للدراسة في بنية الجسم الحي وظيفة من وظائف القشرة المخية الحديثة. تقنية يتطلب تدريب صارم لتصبح مألوفة مع التشريح ذات الصلة والإجراءات الجراحية الدقيقة والمهارات التي تتطلب هذا الإعداد. ويمكن استخدام العمليات الجراحية فقط البكر للتصوير المزمنة. إذا تم التلاعب بها بشكل مفرط أو ثقب الجافية ، لا ينبغي أن تستخدم لإعداد التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl) | Drug | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Isoflurane (Aerrane) | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| Dexamethasone | Drug | Baxter Internationl Inc. | ||
| Ortho-Jet Powder | Reagent | LANG | To be mixed with the acrylic | |
| Jet-Acrylic Liquid | Reagent | LANG | To be mixed with Ortho-Jet Powder | |
| Round Glass Cover Slip | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | 5 mm diameter |
| Gelfoam | Surgery | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Titanium bars are custom-made | ||||
References
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
- Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
- Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
