Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur les cellules de fibroblastes de souris embryonnaires d'alimentation (MEF).
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Article de méthode
De MEFs à I Matrigel: CSEh repiquage en présence du MEF
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur les cellules de fibroblastes de souris embryonnaires d'alimentation (MEF).
Protocole
Fractionnement cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) plaqué sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)
Habituellement une plaque de CSEh confluentes peut être divisé 1:06-1:10, en fonction de la lignée de CSEh particulier. La plaque de répartition ne deviennent confluents nouveau 5-7 jours après la séparation.
- Deux jours avant de se séparer, gélatiniser plaques en utilisant une solution à 0,1% de gélatine. Pour une plaque de 6 puits, ajouter 2 ml dans chaque puits et incuber la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire pendant la nuit.
- Plaque MEFs sur gélatinisé plaques de 6 puits de la journée avant de planifier sur le fractionnement des CSEh. (REMARQUE: FAE peut être plaqué autant que 3 jours plus tôt si nécessaire après ~ 3 jours, MEFs deviennent plus plates et plus étalée et ne peuvent soutenir CSEh ainsi que plus fraîche FAE peut..) Prendre un flacon de g-irradiés ou mitomycine C traités CF1 FAE, contenant 5-6 x 10 6 cellules, à partir de l'azote liquide et le dégel pendant 2 min dans un bain d'eau à 37 ° C. Laver les cellules une fois avec les médias chauds Culture MEF dans un tube 50ml Falcon et remettre en suspension dans le volume final de la Culture des médias chauds MEF. À 5-6 x 10 6 cellules, cela est suffisant pour plaque de deux ou trois plaques de 6 puits.
- Alors que la FAE sont lavés, sortir les plaques gélatinisé, enlever toute solution à partir des puits et ajoutez 2,5 ml de milieux de culture MEF par puits.
- Ajouter 0,5 ml de suspension du MEF par puits pour atteindre 3ml comme un volume final dans chaque puits. Assurez-vous que FAE sont réparties de façon égale et les plaques replacer dans le nuit de régler incubateur.
- Le jour de fractionnement de CSEh, préparer fraîches ou utiliser <2 semaines, âgé de stériles collagénase IV solution à 1mg/ml. Retirez tous les médias à partir des puits de CSEh vous voulez partager, se laver une fois avec 2ml par puits d'une chaude x PBS, pH 7,4, et ajoutez 1 ml de solution de collagénase IV. Incuber à 37 ° C pendant 5-10 min. Prenez la plaque de CSEh à 6 puits hors de l'incubateur et ajoutez 1 ml d'ES médias (sans bFGF) à chaque puits. Utiliser la solution dans chaque puits, avec une pipette 1 ml aspirer les médias et souffler les cellules souches hors de la plaque. Pour chaque puits cela va prendre environ 5 à 10 répétitions. Ensuite, transférez les CSEh en suspension dans un tube de 50ml Falcon. Faites cela pour tous les puits étant diviser et unir en un seul tube 50ml Falcon. Pellet l'CSEh à température ambiante à 200g pendant 5 min et laver une fois avec les médias manquent ES bFGF.
- Alors que les CSEh sont lavés, sortir les plaques du MEF, retirez tous les supports du puits et laver une fois avec stérile, chaud 1 x PBS, pH 7,4, puis ajoutez 2,5 ml d'ES les médias (maintenant complété avec 10 ng / ml de bFGF) par bien.
- Reprendre le CSEh granulés dans un volume approprié des médias ES, complétée par 10ng/ml bFGF. (REMARQUE:.. Lorsque le CSEh sont remises en suspension, ils devraient être à peu près la taille des colonies et des formes, le volume resuspension dépend du rapport de fractionnement) soigneusement la pipette à la suspension de CSEh haut et en bas à quelques reprises de faire des colonies plus petites et plus uniformes, mais pas tant que les cellules uniques ou très petites colonies sont générés. Ajouter 0,5 ml de suspension de CSEh par puits sur les plaques du MEF pour atteindre 3 ml dans un volume final dans chaque puits. Vérifiez visuellement pour s'assurer que les CSEh sont répartis uniformément avant de placer les plaques de retour dans l'incubateur durant la nuit à régler. Après le placage, il prend généralement quelques jours pour les colonies à prendre leur forme caractéristique et l'apparence des frontières.
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Discussion
Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur les cellules de fibroblastes de souris embryonnaires d'alimentation (MEF). Dans la dernière étape avant le placage, quand les CSEh sont remises en suspension, ils devraient être à peu près la taille des colonies et des formes identiques. Soigneusement pipette la suspension de CSEh haut et en bas à quelques reprises de faire des colonies plus petites et plus uniformes, mais pas tant que les cellules uniques ou très petites colonies sont colora...
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Remerciements
Embryonnaires humaines études de cellules souches dans le laboratoire Teitell sont soutenus par un California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Subvention de démarrage RS1-00313. Nous remercions les membres du grand centre de médecine régénérative et de recherche sur les cellules souches à l'UCLA, en particulier le Dr Clark Amander, le Dr Jerome Zack, et des membres de l'UCLA large souches Facilité Institut noyau cellulaire pour leur soutien de nos études.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Substitut de sérum pour cession (KSR) | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 11330-057 | |
| Acides aminés non essentiels | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 11995-065 | |
| Sérum bovin fœtal (FBS) | Réactif | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Réactif | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Réactif | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagénase IV | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Réactif | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Pénicilline / Streptomycine | Réactif | GIBCO, par Life Technologies | 15140-122 | |
| Gélatine | Réactif | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Réactif | BD Biosciences | 354277 | |
| Anticorps anti-Oct-4 | Réactif | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Anti-h/mSSEA-4 conjugué à la phyc–érythrine, IgG3 de souris | Réactif | R&D Systems | FAB1435P | |
| Anticorps secondaire IgG de lapin conjugué à la FITC | Réactif | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Références
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
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