В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерные клетки. Часть 1 из 3.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С MEFs к Матригель I: пассажи ЭСК в присутствии MEFs
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерные клетки.
Протокол
Разделение человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) высевают на эмбриональных фибробластов мыши (MEFs)
Обычно сливной пластины чЭСК можно разделить 1:06 до 1:10, в зависимости от конкретной линии чЭСК. Раскол пластины станет сливной снова через 5-7 дней после расщепления.
- За два дня до расщепления, желировать пластин использованием 0,1% раствора желатина. Для 6-луночный планшет, добавьте 2 мл в каждую лунку и инкубируйте пластинку в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора культуры тканей в одночасье.
- Пластина MEFs на желатинизированный 6-луночных накануне вы планируете расщепления ЭСК. (ПРИМЕЧАНИЕ: MEFs могут быть покрыты целых 3 дня раньше, если это необходимо Через ~ 3 дня, MEFs становятся более плоскими и более расширенным, и не может поддерживать ЭСК, а также свежее MEFs может..) Возьмите пузырек с г-облученных или митомицин С рассматриваться CF1 MEFs, содержащий 5-6 х 10 6 клеток, из жидкого азота и оттаивания в течение 2 мин при 37 ° С водяной бане. Вымойте клетки раз теплой MEF культуры средств массовой информации в 50 мл трубки сокола и ресуспендируют в конечном объеме теплой медиа-культуры MEF. На 5-6 х 10 6 клеток, этого достаточно, чтобы пластины два или три 6-луночных планшетах.
- Хотя в настоящее время MEFs моют, вынимают желатинизированный плиты, удалите все решения из колодцев и добавить 2,5 мл MEF Культурное пространство на лунку.
- Добавить 0,5 мл суспензии в MEF также для достижения 3 мл в качестве конечного объема в каждую лунку. Убедитесь, что MEFs равномерно рассеяны и место пластин еще в инкубаторе ночь отстояться.
- В день чЭСК расщепления, готовить свежие или использовать <2 недельных стерильной коллагеназы IV решение в 1mg/ml. Удалите все носители из чЭСК скважин вы хотите разделить, мыть один раз с 2 мл на лунку теплой 1 х PBS, рН 7,4, и добавьте 1 мл раствора коллагеназы IV. Инкубировать при 37 ° С в течение 5-10 мин. Возьмите 6-а чЭСК пластины из инкубатора и добавить 1 мл ES СМИ (без bFGF) в каждую лунку. Использование раствора в каждую лунку, с 1 мл пипетки подлизываться СМИ и удар стволовых клеток от пластины. Для каждой лунки на это уйдет от 5 до 10 повторений. Затем перенесите приостановлено ЭСК в 50 мл трубки сокола. Сделайте это для всех скважин быть раскол и объединить в одной трубке 50мл сокола. Пеллет ЭСК при комнатной температуре в 200 г в течение 5 мин и мыть один раз со средствами массовой информации ES хватает bFGF.
- Хотя ЭСК в настоящее время моют, вынимают MEF плиты, удалите все носители из колодцев и мыть один раз стерильным, теплой 1 х PBS, рН 7,4 затем добавьте 2,5 мл ES средств массовой информации (в настоящее время с добавлением 10 нг / мл bFGF) в хорошо.
- Ресуспендируют гранулированный ЭСК в соответствующий объем средств массовой информации ES, дополненные 10ng/ml bFGF. (ПРИМЕЧАНИЕ:.. Когда ЭСК ресуспендируют, они должны быть примерно одинакового размера и формы колонии ресуспендирования объем зависит коэффициент разделения) Осторожно пипетки чЭСК подвески вверх и вниз несколько раз, чтобы колонии меньше и более равномерным, но не так много, что отдельные клетки или очень небольшие колонии создаются. Добавить 0,5 мл суспензии в чЭСК хорошо MEF пластин для достижения 3 мл в качестве конечного объема в каждую лунку. Визуально проверить, чтобы убедиться, что ЭСК распределены равномерно до размещения пластин еще в инкубаторе ночь отстояться. После покрытия, оно, как правило, потребуется несколько дней для колоний взять на себя их характерной формы и границы внешний вид.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерные клетки. В последний шаг перед покрытием, когда ЭСК ресуспендируют, они должны быть примерно одинакового размера и формы колонии. Тщательно пипетки чЭСК подвески вверх и вниз несколько раз, чтобы колонии меньше и более равномерным, но не так много, что отдельные клетки или очень маленькие колонии generated.Immunofluorescence окрашивание и микроскопия или проточной цитометрии для чЭСК плюрипотентно...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим членов Широкий Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток в Лос-Анджелесе, особенно доктор Amander Кларк, д-р Джером Зак, и члены UCLA Broad Institute стволовых клеток Основные фонда за поддержку наших исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Заменитель сыворотки Knockout (KSR) | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Незаменимые аминокислоты | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Реагент | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-глутамин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Реагент | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Реагент | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Коллагеназа IV | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Диспаза | Реагент | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Пенициллин / Стрептомицин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Желатин | Реагент | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Реагент | BD Biosciences | 354277 | |
| Антитела к Oct-4 | Реагент | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Конъюгированные с фико–эритрином мышиные IgG3 антитела к h/mSSEA-4 | Реагент | R&D Systems | FAB1435P | |
| Конъюгированные с FITC антитела к IgG кролика | Реагент | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Ссылки
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
