Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

Summary

Hier zeigen wir unsere Methode zur Maus epidermalen Neuralleiste Stammzellen (EPI-NCSC) zu isolieren. Technik beinhaltet Mikro-Sezieren Whisker Follikel, die Isolierung des Bulge und Silber reflektiert sie in Gewebekultur. EPI-NCSC beginnen mit Ausbuchtung Explantate auf das Substrat innerhalb von 3 auswandern - 4 Tage.

Abstract

EPI-NCSC sind Reste der embryonalen Neuralleiste bei einem Erwachsenen Lage, die Wölbung der Haarfollikel. Sie sind multipotente Stammzellen, die die physiologische Eigenschaft auf eine breite Palette von differenzierten Zelltypen, einschließlich Neuronen, Nerven Stützzellen, glatte Muskelzellen, Knochen / Knorpel-Zellen und Melanozyten zu generieren. EPI-NCSC sind leicht zugänglich in der behaarten Haut und kann als hoch reinen Population von Stammzellen isoliert werden. Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Vorbereitung Maus EPI-NCSC Kulturen aus Whisker Follikel. Die Whisker pad einer erwachsenen Maus entfernt wird, und Whisker Follikel zerlegt. Die Follikel sind dann in Längsrichtung und anschließend quer geschnitten oberhalb und unterhalb der Ausbuchtung Region. Die Ausbuchtung wird aus dem Kollagen Kapsel entfernt und in eine Kulturschale. EPI-NCSC beginnen mit der Ausbuchtung Explantate 3 bis 4 Tage später emigrieren.

Protocol

Dissection of the Bulge von erwachsenen Maus Whisker Follikel

1. Wir verwenden 10 Wochen bis 6 Monate alten Mäusen. Jüngere Mäusen liefern oft mehr Zellen. Euthanize Maus und tauchen ganze Tier in 1:1-Mischung von betadine (Iodlösung) und Wasserstoffperoxid (erhältlich von der Apotheke) für ca. 3 Minuten.
   
2. Squirt gesamte Maus, vor allem das Gesicht, mit 75% Ethanol, und tragen Maus Dissektionsmikroskop in Laminarströmungshaube.
3. Dissect Schnurrhaarkissen, sorgfältig zu vermeiden Einschneiden Haarzwiebeln, und Pool in HBSS.
4. Dissect Whisker Follikel und Pool in HBSS bei Raumtemperatur. Tun Sie dies, indem Haut neben Haarfollikel mit einer Pinzette und dann Schneiden um den Follikel mit der geraden Schere. Cut tief zu verletzen Haarwurzeln.
5. Heben Sie Whisker Follikel von Whisker-Pad und in neue Platte mit frischem HBSS.
6. Flush verlieren adipous und Hautgewebe mit spritzt Puffer, bis Whisker Follikel sauber sind. Wenn nötig, schneiden Nerv Whisker Follikel und entfernen anhaftendem Gewebe durch Schaben und wiederholte Spülungen der HBSS.
7. Pin sauberes Haar follilce auf Sylgard-beschichtetes Glas-Petrischale mit geschärften Wolfram Nadeln, mit microforceps zur Aufnahme auf die Haut Teil neben dem Follikel.
8. Cut Whisker Follikel longitudically mit einem MicroBlade. Vermeiden Sie zu tief, da dies die Ausbuchtung verletzen wird. Entfernen Sie Blut spritzt wiederholt HBSS bis gegangen. Auftreten von Blut ist ein gutes Indiz dafür, dass der Schnitt tief genug war. Wenn der Längsschlitten Schnitt ist nicht lang genug, kann es mit gebogenen Mikroschere verlängert werden.
9. Machen Sie einen Schnitt quer über dem Niveau des Sinus cavernosus und anschließend eine zweite Schnitt quer auf der Ebene innerhalb des Rings Sinus, um die Haut zu schließen.
10. Sie sehen nun die Ausbuchtung im Inneren der Kapsel.
11. Schnappen Sie ein Ende zu Kollagenkapsel mit der Zange und Roll-out der Ausbuchtung mit einem gebogenen Wolframnadel. Sie sehen nun die leere Kapsel und das isolierte Ausbuchtung.
12. Pool isoliert Ausbuchtungen in einem separaten Kulturplatte in HBSS bei Raumtemperatur. Achten Sie darauf, keine andere Gewebe ist eine Verunreinigung des gepoolten Ausbuchtungen.

Culture of Bulge Explantate

1. Coat 35 mm Kulturschalen mit Kollagen, indem 50 pl Kollagen und 10 ul sterilem 6% NaCl nebeneinander. Gut mischen mit einem Doppel-gebogen Pasteyr Pipette und drücken Sie auf den Rand der Kulturschale. Inkubieren über Nacht in einem sauberen Exsikkator, aber nicht trocknen lassen. Vor dem Gebrauch gründlich die Platten mit Kochsalzlösung.
2. Pre-Inkubation Kollagen-beschichteten und gespült Kultur-Platten für ca. 3 Stunden mit Kulturmedium. Kulturmedium besteht aus 85% Alpha-modifizierten MEM, 10% fötalem Rinderserum und 5% Tag 11 Hühnerembryo-Extrakt.
3. Nach erneuter Inkubation entfernen Kulturmedium aus Platten und fügen mehrere Ausbuchtungen mit möglichst wenig Medium wie möglich. Entfernen Sie das überschüssige Kulturmedium.
4. Inkubation für 1 Stunde, aber nicht mehr, in Zellinkubator in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10% Sauerstoff und 5% CO _2.
5. Nach 1 Stunde sanft 1,5 ml Kulturmedium. Bulge Explantate sollten, um das Kollagen Substrat haften. Ersetzen Sie 50% des Kulturmediums täglich.
6. Innerhalb von 3 bis 4 Tagen werden weit wandernden Zellen aus dem Wulst Explantate auszuwandern. Beachten Sie ihre sternförmige Morphologie, Motilität und vorherrschenden Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakten. In den nächsten Tagen werden mehrere Zellen auswandern, und emigrierte Zellen rasch vermehren.
7. Entfernen Ausbuchtung 2 bis 3 Tage nach Beginn der EPI-NCSC Auswanderung mit einem geschärften Wolframnadel. Wenn die Ausbuchtungen länger bleiben, neigen sie zu glätten und machen es unmöglich, reine EPI-NCSC Kulturen zu erhalten.
8. Wichtig: Rare Zellen mit abgeflachten Morphologie, die manchmal sichtbar werden einige Tage später als EPI-NCSC, und welche weniger beweglich sind NICHT EPI-NCSC, aber putative epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellen. Kulturen aus diesen Zellen, oder Mischkulturen mit EPI-NCSC und vermeintlichen epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellen müssen entsorgt werden.
9. Tipp: Bewahren Sie keine der Zellen zu lange in primäre Explantat Medium, da sie schnell zu differenzieren bei hoher Zelldichte, vermeintlich durch autokrine / parakrine growth factor Signalisierung neigen.

Discussion

Aufgrund ihrer Fähigkeit, wandernde, kann EPI-NCSC als hochreines Population von Stammzellen, die in vitro erweitert werden kann isoliert werden. Da embryonale Reste eines erwachsenen Lage sind EPI-NCSC potenziell attraktive Kandidaten für die zukünftige Zellersatztherapien, Biomedizintechnik und / oder der regenerativen Medizin. Wir haben EPI-NCSC in einem Mausmodell für Rückenmarksverletzungen getestet, wo sie wünschenswerte Merkmale zeigen. Durch Genexpressionsanalysen von LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo, Seriennummer GSE4680) haben wir gezeigt, dass, wie erwartet, embryonalen Zellen der Neuralleiste und EPI-NCSC teilen ein ähnliches Genexpressionsmuster, die von der benachbarten unterscheidet epidermalen Stammzellen und anderen Hauterkrankungen ansässigen Stammzellen / Vorläuferzellen.