Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

Summary

In diesem Artikel werden wir zeigen, wie das zentrale Nervensystem aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren.

Abstract

Das zentrale Nervensystem (ZNS) von Drosophila-Larven ist komplex und kaum verstanden. Ein Weg, um das ZNS zu untersuchen ist, Immunhistochemie verwenden, um die Expression von verschiedenen neuen und Markerproteine ​​zu untersuchen. Die Färbung des ganzen Larven ist unpraktisch, weil die harten Kutikula verhindert das Eindringen von Antikörpern in der Körperhöhle. Um diese Gewebe Fleck ist es notwendig, das Tier vor sezieren, um Fixierung und Färbung. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie Drosophila-Larven ohne Beschädigung des ZNS zu sezieren. Beginnen Sie mit dem Reißen der Larve in Hälfte mit einer feinen Pinzette, und biegen Sie dann die Kutikula "inside-out" des ZNS aussetzen. Wenn die Dissektion sorgfältig durchgeführt wird, das ZNS bleibt an der Nagelhaut. Wir halten in der Regel das ZNS an der Kutikula der ganzen Fixierung und Färbung Schritte, und nur die vollständige Entfernung des ZNS von der Kutikula kurz vor der Montage der Proben auf Glasträger. Wir zeigen auch einige repräsentative Bilder eines larvalen ZNS mit Eve, ein Transkriptionsfaktor in einer Untergruppe von Neuronen im ZNS exprimiert gefärbt. Der Artikel schließt mit einer Diskussion über einige der praktischen Anwendungen dieser Technik und die möglichen Schwierigkeiten, die entstehen können.

Protocol

1. Dissect 3 ^rd Larvenstadium, so dass CNS an der Nagelhaut. Legen Sie in einem 1,5 ml-Tube.
2. Fix in PBS (1x) mit 2% Formaldehyd für 40 min mit Schaukeln. ; Verwenden 250ul für alle 5-10 seziert ZNS.
3. Entfernen Formaldehyd und kurz 3 x waschen mit PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Verwenden Sie ein fein gezogen Pasteurpipette, um den Verlust von Gewebe zu vermeiden.
4. Block nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen und permeabilisieren Zellmembranen durch Inkubation Gewebe 1-8 Std. in PBST + 5% BSA, Schütteln bei 4 ° C.
5. Inkubieren in Primärantikörper in PBST + 5% BSA Schütteln bei 4 ° C über Nacht verdünnt. Optimal Antikörperverdünnung wird für verschiedene Antikörper variieren.
6. Spülen Sie 3x in PBST durch zwei 30min Wäschen bei 4 ° C, gefolgt
7. Inkubieren in sekundären Antikörper in PBST verdünnt + 5% BSA für 1-3 Stunden Schütteln bei 4 ° C. Spülen Sie 3x in PBST durch zwei 30min Wäschen bei 4 ° C, gefolgt Wenn der sekundäre konjugiert ist eine lichtempfindliche Verbindung, wickeln Sie das Rohr in Alufolie.
8. Dissect Gewebe weiter (falls nötig) und montieren Sie auf Folien.

Discussion

Dieses Video zeigt, wie das ZNS aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren. Nach der Präparation kann das ZNS gefärbt mit einem Standard-Immunhistochemie Protokoll. Derzeit ist vieles noch unbekannt, wie die erwachsenen Nervensystem ist und wie es speichert generiert und übermittelt Informationen. Studien über die Entwicklung von Drosophila Larve ZNS sollte unser Wissen darüber, Nervensystem Verdrahtung und Funktion.

Drosophila-Larven weisen eine Reihe von stereotpyed Verhaltensweisen wie eine Reaktion auf Umweltreize. Wie sind diese Verhaltensweisen erlernt und in das Nervensystem? Studium des Nervensystems während der Entwicklung der Larven wird dazu beitragen, diese Frage zu beantworten.

In dieser Phase in der Drosophila-Entwicklung, ist der Organismus bereitet sich die große morphologische Veränderungen, die während der Verpuppung auftreten zu unterziehen. Während dieser Zeit tritt massiven Umbau des neuromuskulären Systems als organsim Übergänge von einer kriechenden Maden in einem Erwachsenen fliegen. Es wird interessant sein zu bestimmen, wie Neuronen während dieser Phase der Entwicklung zu ändern, und wenn die gleiche Art von Verhaltensweisen in den Neuronen der höheren Tiere beobachtet werden können.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish