Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Kurulum
<ol>
	<li>Tüm materyalleri, aşamalı deney protokolünü ve malzemeleri atma yöntemini listeleyen bir akış şeması bir laboratuvar defterine yazılmalı ve deney çalışma alanının yakınında tutulmalıdır. </li>
	<li>Çalışma alanları uygun bir antiseptik (%70 etanol) ile sterilize edilmeli ve deneyci, onları maruziyet anormalliklerinden de koruyan temiz laboratuvar giysileri giyerek kontaminasyon riskini azaltmalıdır. Uygun giysiler arasında laboratuvar önlüğü, lateks veya nitril eldivenler, gözlükler, solunum maskeleri ve kapalı ayakkabılar bulunur ancak bunlarla sınırlı değildir. Her zaman aseptik tekniği korumak çok önemlidir. </li>
	<li>90 mL% 0.45 tuzlu su hazırlayın. Temiz dereceli bir silindir kullanarak, 90 mL steril su ölçün ve % 0.45 tuzlu su etiketli temiz bir Erlenmeyer şişesine aktarın. .405 g sodyum klorür (Sigma-Aldrich NaCl S9888) tartın ve %0.45 salin etiketli şişeye ekleyin. Hiçbir çözünen madde kalmayana kadar art arda döndürün. </li>
	<li>Tamamlandıktan sonra, deneyci tüm yüzeyleri yeniden sterilize etmeli ve istenmeyen organizmaları, seyreltici stokları, petri kaplarını veya tek kullanımlık aşılama döngülerini OSHA yönergelerine göre atmalıdır. Laboratuvar giysileri eller yıkanmadan önce çıkarılabilir. </li>
</ol>
2. Medya Hazırlığı
<ol>
	<li>İstenilen bir organizmanın yetiştirilmesi için uygun ortamı seçin. Çoğu senaryoda, bir et suyu yeterli bakteri üremesini sağlayacaktır. Burada bir Winogradsky protokolünden organizmalar istendiğinden, kalsiyum karbonat, kükürt, selüloz ve çamurdan oluşan bir sütun monte edildi ve 7 gün boyunca bozulmadan bırakıldı. Yukarıda belirtilen sütun aerobik, mikroaerofilik ve anaerobik bölümlere ayrılmıştır. </li>
	<li>İlgilenilen organizmayı kaplamak için uygun bir ortam seçin. Sıvı ortamın mikrobiyoloji dereceli agar ile takviyesi tipik olarak katılaştırıcı bir ajan olarak kullanılır. Yukarıda belirtilen sütunun aerobik, mikroaerofilik ve anaerobik bölgelerinden numuneler toplanırken LB medium/agar yeterlidir. Not: Bu prosedür için mikroaerofilik bölgeden örnekler alınmamıştır. Bununla birlikte, bu organizmalar mum kavanozlarında yetiştirilmelidir. Sızdırmazlıktan önce bu yetiştirme odasına bir mum eklemek, mikroaerofilik çoğalma için uygun olan düşük oksijenli bir ortam yaratır. </li>
	<li>250 mL hazırlamak istediğimizden, otoklavlama sırasında kaynamayı önlemek için 500 mL (veya daha büyük) Erlenmeyer şişeleri kullanın. Birini "Et suyu" ve diğerini "Agar" olarak etiketleyin</li>
	<li>Üreticinin konsantrasyon önerilerini takip ederek her bir çözeltiyi oluşturmak için gereken ortam miktarını belirleyin. Burada kullanılan LB Agar, 25g/L ile ultra saf suyun birleştirilmesiyle hazırlanır. 250 mL'lik hacmimiz 6,25 LB Agar/250 mL su çözeltisi gerektirir. Benzer şekilde LB Broth da aynı oranda LB Broth ve suyun birleştirilmesiyle hazırlanır. Katılaştırıcı bir madde ile desteklenmediğinden, soğutulduğunda sertleşmez. </li>
	<li>Ortamı tartın ve üretici tavsiyelerine uygun oranlarda suyla karıştırın. "Agar" etiketli bir şişeye 6.25 g LB Agar ve "Et suyu" etiketli bir şişeye 6.25 g LB Suyu ekleyin. Her şişeye 250 mL ultra saf su ekleyin. </li>
	<li>Her şişenin üzerine alüminyum folyo sarın ve ortamı 121 ° C, 15 psi'de en az 15 dakika sterilize etmek için bir otoklav kullanın. </li>
	<li>Isıya dayanıklı bir eldiven veya ped kullanarak, döngü tamamlandığında şişeleri otoklavdan çıkarın ve 40-50°C'lik bir su banyosuna koyun. </li>
	<li>Uygun sıcaklığa ulaşıldığında, "Et suyu" etiketli şişenin içeriğini 250 mL'lik bir Erlenmeyer'e veya yuvarlak tabanlı şişeye dökün. 250 mL'lik şişeyi "solution0" olarak etiketleyin. </li>
	<li>10, 100 mm x 15 mm steril petri kapları alın ve bunları tarih, isim, kullanılan ortam türü ve organizmaların hasat edileceği Winogradsky sütun bölgesi ile etiketleyin. </li>
	<li>"Agar" etiketli matarayı su banyosundan çıkarın ve 10 petri kabının her birine dökmeye başlayın. Her yemeğe 15 mL'den fazla eklenmemelidir. Bu, doğruluğu artırmak için bir pipetleyici ve 25 mL serolojik pipet ile de gerçekleştirilebilir. Mevcut kabarcıkları çıkarmak için steril bir pipet ucu kullanın ve ardından plaka kapaklarıyla örtün ve gece boyunca katılaşmaya bırakın. </li>
</ol>
3. Seyreltici Hazırlama
<ol>
	<li>Bir rafta 20 mL veya daha fazla depolayabilen on test tüpü hazırlayın ve bunları T1-T10 olarak etiketleyin. Her tüp numarası, karşılık geldiği seyreltme faktörü ile tutarlıdır (yani, T4 = 1x10-4 veya 0.0001 veya stok konsantrasyonunun 1/10.000'i). </li>
	<li>10 test tüpünün her birine 9 mL% 0.45 salin pipetleyin. </li>
	<li>Tuzlu su boşlukları artık otoklav ile sterilize edilmeye hazırdır. 10 test tüpünün her birini kaplamak için alüminyum folyo kullanın ve ardından bunları otoklav uyumlu bir test tüpü rafına aktarın. 121 ° C, 15 psi'de en az 15 dakika sterilize edin. </li>
	<li>Isıya dayanıklı eldivenler kullanarak boşlukları çıkarın ve soğumaya bırakın. Tüpler oda sıcaklığına ulaştığında veya dokunulamayacak kadar soğuduğunda ihtiyaç duyulana kadar örtün ve 4°C'de saklayın. </li>
</ol>
4. Hedef Organizmanın Yetiştirilmesi
<ol>
	<li>"Çözelti0" yi daha önce çizgili bir plakadan veya 50 μL donmuş bir stoktan tek bir koloni ile aşılayın. Aşılanmış "çözelti0" yi gece boyunca çalkalayarak (gerekirse) 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirerek hedef organizmanın çoğalmasına izin verin. (Not: Kontaminasyonu önlemek için şişenin üzeri kapatılmalıdır. Hedef organizma aerobik ise, kontaminasyonu önlemek için steril gazlı bez ve pamuklu tıkaçlar kullanın. Winogradsky kolonunun bölgelerini değerlendiriyorsanız, istenen her bölgeden (bu çalışmanın amaçları için aerobik ve anaerobik) 1 gram çıkarın ve adım 5.3'e geçmeden önce T1'de yeniden süspanse edin. </li>
</ol>
5. Seri Seyreltme
<ol>
	<li>Kuluçka makinesinden "Besin suyu" etiketli şişeyi alın ve kuvvetlice çalkalayın. </li>
	<li>1 mL "çözelti0" pipetini T1 etiketli test tüpüne uygulayın. Girdap T1. Winogradsky eksplantlarını değerlendiriyorsanız, istenen bölgenin 1 gramını tartın ve girdaplamadan önce T1'e ekleyin. (Not: Basitlik için burada 1 mL kullanılmıştır - daha küçük veya daha büyük hacimlerde seyreltici de kullanılabilir). </li>
	<li>Test tüpü T1'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T2'ye ekleyin. Girdap T2. </li>
	<li>Test tüpü T2'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T3'e ekleyin. Girdap T3. </li>
	<li>Test tüpü T3'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T4'e ekleyin. Girdap T4. </li>
	<li>Test tüpü T4'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T5'e ekleyin. Girdap T5. </li>
	<li>Test tüpü T5'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T6'ya ekleyin. Girdap T6. </li>
	<li>Test tüpü T6'dan 1 mL çıkarın ve test tüpü T7'ye ekleyin. Girdap T7. </li>
	<li>Test tüpü T7'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T8'e ekleyin. Girdap T8. </li>
	<li>Test tüpü T8'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T9'a ekleyin. Girdap T9. </li>
	<li>Test tüpü T9'dan 1 mL çıkarın ve test tüpü T10'a ekleyin. </li>
</ol>
6. Yayılmış Kaplama
<ol>
	<li>T1'den 100 μL seyreltilmiş bir numuneyi doğrudan bir petri kabına pipetleyin. Bu adım her tüp için tekrarlanabilir, ancak tekrarlanması gerekmez. </li>
	<li>Steril, tek kullanımlık bir yayma çubuğu edinin veya bir cam yayma çubuğunu alevle sterilize edin. Saat yönünde/saat yönünün tersine hareketlerle, numuneyi petri kabı içinde eşit olarak dağıtmak için yayma çubuğunun yatay kısmını kaydırın. </li>
	<li>Winogradsky sütununun değerlendirilecek her bölgesi için tekrarlayın. </li>
	<li>Plakaları 37°C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin. Anaerobik organizmalar için anaerobik bir oda kullanın. </li>
</ol>
7. Çizgi
<ol>
	<li>Hedef organizmanızın uygun bir seyreltmesini seçin. Örneğin, 4 çözeltisi, başlangıç konsantrasyonunuzun 1/10.000'inci seyreltmesini verecektir. Tipik olarak, 1/1.000inci (T3/Çözelti), 1/1.000.000inci (T6/Çözüm6) ve 1/1.000.000.000inci (T9/Çözüm9) seyreltmeleri mikropları numaralandırmak için değerlendirilir. </li>
	<li>Plastik steril tek kullanımlık bir aşılama halkası veya en az 10 saniye boyunca ateş altında kalmış yeniden kullanılabilir bir metal aşılama halkası kullanarak, 5. adımdan itibaren istenen çözeltiye daldırın. Kalibre edilmiş aşılama döngüleri 0.01 mL transfer etmelidir. (Dikkat: Isıdan çıkardıktan hemen sonra alevli halkanın bakterilerle temas etmesine izin vermeyin)</li>
	<li>Bir taraftaki petri kabı kapağını hafifçe kaldırın, böylece sadece aşılama halkası agar'a erişebilir. Agardan ödün vermemeye dikkat ederek aşılama halkasını medyanın üst kısmında zikzak şeklinde kaydırın. Petri kabı kapağını indirin. </li>
	<li>Yeni bir tek kullanımlık aşılama halkası kullanın veya yeniden kullanılabilir döngünüzü yeniden sterilize edin. </li>
	<li>Plakayı kabaca 1/3rd (~118°) döndürün ve zikzak hareketinin sıklığını azaltın. </li>
	<li>Yine, son bir kez döndürmeden önce yeni bir tek kullanımlık halka kullanın veya metal bir halkayı yeniden sterilize edin ve zikzak frekansını bir kez daha azaltın. Petri kabı kapağını indirin. </li>
	<li>7.2 - 7.6 arasındaki adımları, yeni bir tek kullanımlık döngü kullanarak veya yeniden kullanılabilir bir döngüyü yeniden alevlendirerek üç farklı seyreltme için en az üç petri kabı çizilene kadar tekrarlayın (Şekil 2). </li>
	<li>Çizgili petri kaplarını gece boyunca 37°C'lik bir inkübatöre koyun. Anaerobik organizmalar için anerobik bir oda kullanın. </li>
</ol>
8. Veri Analizi ve Sonuçlar
<ol>
	<li>Kültürler, 7 günlük bir Winogradsky sütununun oksik ve anoksik bölgelerinden toplandı. Bu bölgeler sırasıyla heterotrofik ve demir oksitleyici anaeroblar için uygundur. </li>
	<li>Kolon eksplantları, LB Agar plakaları üzerinde çizgilenmeden veya yayılmadan önce seri olarak seyreltildi. </li>
	<li>Çizgi, değerlendirilen Winogradsky bölgelerinin her birinden karışık bir popülasyon ortaya çıkardı. Yayılmış plakalar da benzer sonuçlar verdi. </li>
	<li>CFU/mL veya CFU/g'yi hesaplamak için, üç plakadan sayılan koloni sayısının ortalamasını alın. Ortalama koloni sayısını seyreltme faktörü ile çarpın ve alıntılanan miktara bölün. Örneğin, 0.1 mL çözelti6 (T6) ile aşılanmış plakalarda ortalama 65 koloni sayılırsa, daha önce açıklanan formül 650.000.000 CFU/mL'ye eşit olacaktır. </li>
	<li>İzole edilmiş koloniler artık tür kimliğini belirlemek için zenginleştirme tahlillerinde kullanılmak üzere her plakadan seçilebilir. </li>
</ol>

Kaplama yoluyla bakteri sayımı ve suş izolasyonu, hedef organizmaların yönetilebilir konsantrasyonlarını gerektirir. Bu nedenle başarılı kaplama seri seyreltmeye bağlıdır. Bu nedenle, yukarıda belirtilen teknikler mikrobiyolojik inceleme ve deneylerin temel taşı olmaya devam etmektedir. Tasarım gereği basit olmasına rağmen, seyreltme faktörleri ve kaplama tekniği, her yöntemin bütünlüğünden ödün vermeden sonuçları desteklemek için deneyci tarafından değiştirilebilir. Bakteri üremesinin dört aşamasını çizmek, istenen mikropları karakterize ederken yardımcı olabilir. Bu aşamalar, gecikme, log, durağan ve ölüm, bakteri replikasyonundaki değişikliklerle işaretlenir. Gecikme fazı, fizyolojik adaptasyon nedeniyle yavaş büyümeye sahiptir, log fazı, canlı hücrelerde üstel bir artış içeren maksimum proliferasyon periyodudur, daha sonra hücre sayılarının düşmeye başladığı ölüm fazından önce çevresel sınırlamalar ve toksin birikimleri nedeniyle durağan faza ulaşılır. Bu, Çözelti0'ın Zaman0'dan başlayarak toplam 8 saat boyunca her saat başı seri olarak seyreltilmesiyle (veya karışıklığı önlemek için 1 adımlı seyreltme) gerçekleştirilebilir (Çözelti0, her seyreltmeden sonra çalkalayan bir inkübatöre geri döndürülmelidir). Zaman 0'ın tek bir seyrelticisi için CFU/ml'nin log10'unu hesaplayın ve Y ekseninde çizin. Bu hesaplamayı örnek Zaman1 için tekrarlayın (CFU/mL'yi Zaman0 ile aynı seyreltme faktörünü kullanarak hesapladığınızdan emin olun). Her seferinde (Zaman1-Zaman 8) X ekseninde çizilene kadar tekrarlayın.

seri seyreltmeler ve kaplama: mikrobiyal sayım

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Kaynak: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1 ve Christopher P. Corbo1 
1 Wagner Koleji, Biyolojik Bilimler Bölümü, 1 Kampüs Yolu, Staten Island NY, 10301
Prokaryotların nicel değerlendirmesi, bollukları, üstel çoğalma eğilimleri, bir popülasyon içindeki tür çeşitliliği ve belirli fizyolojik ihtiyaçlar göz önüne alındığında zahmetli olabilir. Bu zorluğu bir araya getiren, bakterilerin çoğaldığı dört fazlı doğadır (gecikme, log, durağan ve ölüm). Mikroorganizma konsantrasyonunu doğru bir şekilde tahmin etme yeteneği, başarılı tanımlama, izolasyon, yetiştirme ve karakterizasyon için gereklidir (6). Bu nedenle, mikrobiyologlar klinik, endüstriyel, farmasötik ve akademik laboratuvar ortamlarında bakteriyel ve viral yükü güvenilir bir şekilde ölçmek için yüzyılı aşkın bir süredir seri seyreltme ve çeşitli kaplama teknikleri kullanmışlardır (2,4,6). Bu metodolojinin açıklamaları ilk olarak 1883 yılında Alman bilim adamı ve doktor Robert Koch'un bulaşıcı hastalıklara neden olan ajanlar üzerine yaptığı çalışmaları yayınladığında ortaya çıkmıştır (2). Genellikle modern bakteriyolojinin babası olarak anılan Koch'un önceden adlandırılmış teknikleri, dünya çapında kültürlenebilir veya başka türlü mikroorganizmaların sayımı için altın standart haline gelmiştir. 
Seri seyreltme, bilinen veya bilinmeyen bir varlığın (bir çözünen, organizma, vb.), bir başlangıç çözeltisinin (çözelti0) sabit hacimlerde bir sıvı seyrelticiye (boşluklar) art arda yeniden süspansiyonu yoluyla sistematik olarak indirgenmesidir. Bu boşluklar genellikle% 0.45 salin içerir, ancak bileşim değişebilir (7). Bir deneyci her seyreltici için herhangi bir hacim seçebilse de, çoğu zaman 10'un katıdır ve numunenin logaritmik olarak azaltılmasını kolaylaştırır. Örneğin, 0 çözeltisi, 10 mL besin suyu içinde süspanse edilmiş toplam 100 E. coli hücresi içerir. 1 mL çözelti0 çıkarılır ve 9 mL tuzlu suya (seyreltici1) eklenirse, yeni çözelti (çözüm1), E. coli'nin başlangıç konsantrasyonunun 1/10'inci'ini içerecektir. Bu örnekte, yeni çözüm (çözüm1) 10 E. coli hücresi içerecektir. 1 mL çözelti1 çıkararak ve başka bir 9 mL tuzlu suya (seyreltici2) ekleyerek bu işlemi tekrarlamak, yalnızca tek bir E. coli hücresi içeren 2 çözeltisi verir. Her yeni çözelti (9 mL seyreltici + 1 mL çözelti) toplam 10 mL içerdiğinden, bu indirgeme için seyreltme faktörünün 10 olduğu veya bunun 10 kat seri seyreltme olduğu sonucuna varabiliriz (Şekil 1). Bu örnekte sadece 100 hücre ile başladığımız ve 10 kat seyrelttiğimiz için, 1 hücrenin mutlak minimum konsantrasyonuna ulaşmak için sadece iki adım gereklidir. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> 
Şekil 1: Bir stok çözeltisinin seri seyreltilmesi. 1 mL'lik bir stok çözeltisi alikotu (çözelti0), 9 mL% 0.45 salin (dilent1) içeren tüp 1'e eklenir; Bu karışımın ürünü çözelti1'dir. Yeni oluşturulan çözeltinin 1 1 mL'sini alıntılayarak ve tüp 2'ye ekleyerek tekrarlayın. Alikotasyon ve yeniden süspansiyon, son tüpe ulaşılana kadar bu şekilde devam eder ve stok konsantrasyonunu her adımda 10 kat seyreltir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. </a>
Seri seyreltme, istenen bir organizmanın yönetilebilir konsantrasyonlarını elde etmek için en basit tekniktir ve mikrobiyologlar tarafından kullanılan birçok kaplama tekniğinden sadece ikisi olan petri kabı çizgileme ve yayma ile tamamlanır. Bu yaklaşımın bu yararı, deneycinin tek bir türün saf suşlarını toplayabilmesi veya karışık bir popülasyondan suşları ayırabilmesidir (7). Çizgilenme, bir organizmanın, uygun besinler mevcutsa üzerinde büyüyeceği katı bir ortama (genellikle agarozdan oluşan) sokulmasıyla gerçekleştirilir. Steril bir aşılama halkasını ortam boyunca (ince bir çizgi kalacak şekilde) sert bir sinüzoidal modelde nazikçe süpürmek, organizmayı deneycinin dalga formunun frekansı ile orantılı olarak dağıtacaktır. Petri kabını üçe veya dörde bölmek (kadran çizgisi) ve çanağın yeni bir bölgesine girildikçe her çizginin sıklığını azaltmak, o bölgeyi işgal edebilecek mikroorganizmaların sayısını kademeli olarak azaltacak ve ölçülemeyen bir bakteri çimi yerine tek koloniler üretecektir. Yayılmış kaplama ayrıca numuneleri seyreltmez; steril bir cam yayıcı, bir dizi süspansiyon ortamını tüm petri kabına dağıtmak için kullanılır (Şekil 2). Yayılmış plaka üzerinde büyüyen koloniler tek bir hücreden kaynaklanır ve çanak üzerindeki her koloni, CFU/mL olarak temsil edilen belirli bir süspansiyonda mililitre (CFU) başına koloni oluşturan birimlerin sayısını tahmin etmek için sayılabilir (6) (Şekil 3) Yumuşak agar ve replika kaplama, yukarıda belirtilen tekniklerin varyasyonlarıdır ve bakteriyofaj ve mutant taramanın izolasyonuna izin verir, sırasıyla (1,7). 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> 
Şekil 2: Bakteri sayımı ve gerinim izolasyonu için plaka çizgisi. Bir petri kabının altını kimlik bilgileriyle (bakteri adı, tarih, ortam) etiketleyin ve üçe bölün. Stok numunesinin uygun bir seyreltmesini seçtikten sonra, steril (tek kullanımlık veya alevli) bir aşılama halkası alın ve test tüpüne daldırın (burada, T3). Bir taraftaki petri kabı kapağını hafifçe kaldırın, böylece sadece aşılama halkası agar'a erişebilir. Agardan ödün vermemeye dikkat ederek aşılama halkasını medyanın üst kısmında zikzak şeklinde kaydırın. Plakayı kabaca 1/3rd (~118°) döndürün ve zikzak hareketinin sıklığını azaltın. Son bir kez döndürün ve zikzak frekansını bir kez daha azaltın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. </a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> 
Şekil 3: Yayılmış kaplama. 1 g aerobik bölge T1'de yeniden süspanse edildi ve daha sonra seri olarak seyreltildi. Her yemeğe aşı dağıtmak için steril bir cam veya plastik tek kullanımlık yayma çubuğu kullanılır. Bu, 1 g anaerobik bölge ile tekrarlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. </a>
Seri seyreltmelerde olduğu gibi, organizma konsantrasyonunu ifade etmek için logaritmik bir ölçek kullanılır. 100 mm x 15 mm ölçülerindeki standart petri kaplarında yetiştirilen kolonilerin sayısı, izole edilmiş büyüme kümelerini tanımlayarak manuel olarak (veya hesaplamalı işleme yardımıyla otomatikleştirilebilir) numaralandırılabilir. Toplamı 30'dan az veya 300'den büyük olan sayımlar, sırasıyla sayılamayacak kadar az (TFTC) veya sayılamayacak kadar çok (TNTC) olarak tanımlanmalıdır. İkincisi durumunda, yeni bir petri kabını yeniden doldurmadan önce konsantrasyonu azaltmak için seri bir seyreltme yapılmalıdır. Üç ayrı petri kabından tanımlanan bağımsız kolonilerin sayısının ortalamasının alınması ve ortalamanın seyreltme faktörü ile çarpılması CFU/mL verecektir; CFU/mL'nin 10 logunu zamana karşı çizmek, organizmanın ortalama üretim süresini ortaya çıkaracaktır (7).

Seri Seyreltmeler ve Kaplama: Mikrobiyal Sayım

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

Bazen, bakterileri tanımlamak ve incelemek için önce onları bir numuneden izole etmemiz ve zenginleştirmemiz gerekir. Örneğin, bir Winogradsky Sütunundan elde edilen örnekler karışıktır, yani birden fazla bakteri türü veya türü içerirler, bu nedenle tek bir bakteriyi incelemek veya mevcut farklı türleri numaralandırmak zor olabilir. Bu amaçla, bakteri yükünü güvenilir bir şekilde ölçmek ve tek tek kolonileri izole etmek için tipik olarak seri seyreltme ve kaplama teknikleri kullanılır. Seri seyreltme, bir organizmanın, bu örnekteki bakterilerin konsantrasyonunun, sabit hacimlerde sıvı seyreltici içinde ardışık yeniden süspansiyon yoluyla sistematik olarak azaltıldığı bir işlemdir. Genellikle seyrelticinin hacmi, numune organizmasının logaritmik indirgenmesini kolaylaştırmak için 10'un katıdır. Örneğin, bir gram tortu önce Winogradsky'nin ilgilendiği bölgeden çıkarılır ve 10 mililitre uygun bir sıvı ortama eklenir. Daha sonra, bu ilk seyreltmenin bir mililitresi, dokuz mililitre ortam içeren başka bir tüpe eklenir. İşlem, birkaç farklı bakteri konsantrasyonu hazırlanana kadar tekrarlanabilir. Seri seyreltme, bu örnekteki bakterilerin sayımının anahtarıdır, çünkü bir Winogradsky Sütunundan alınan karışık örnekler bilinmeyen, genellikle büyük sayıda bakteri içerir. Daha sonra, çizgi kaplama ve yayılmış kaplama, sırasıyla bir numune içindeki bakterilerin izolasyonunu ve sayımını sağlar. Çizgileme, seyreltilmiş bir numunenin, besin maddesi ile takviye edilmiş katı ortamın üçe bölünen bir bölümüne sokulmasıyla gerçekleştirilir. Bu aşı daha sonra zikzak şeklinde plakanın her üçte birine yayılır. Plakanın farklı bölümleri, önceki numuneden yalnızca bir kez geçecek şekilde çizgili olduğundan, numune daha ince yayılır. Bu, sonraki bölümlerde tek tek koloniler elde etmek için yalnızca bir seyreltmeden çizgi çekmeniz gerekebileceği anlamına gelir. İnkübasyondan sonra, çizgili plakalar, farklı bakteri türleri arasında ayrım yapmaya yardımcı olabilecek bilgiler olan koloni morfolojisinin gözlemlenmesine izin verir. Alternatif olarak, asıl amaç numunedeki bakterilerin sayımı ise, yayılmış kaplama kullanılabilir. Yayılmış kaplamada, tek bir numunenin bir alikotu katı ortamın tüm yüzeyine eşit olarak yayılır. Tipik olarak, karışık numunedeki bakteri sayılarını bilmediğimiz için, seyreltmelerin her biri veya bunların temsili bir numunesi için bir yayma plakası yapılır. İnkübasyondan sonra, bu yayılmış plakalar kullanılarak numaralandırma yapılabilir. Koloni sayısı 30'dan az olan plakalar atılmalıdır, çünkü küçük sayımlar daha büyük hatalara maruz kalır. Benzer şekilde, 300'ün üzerindeki herhangi bir sayım atılmalıdır, çünkü koloni kalabalıklaşması ve üst üste binmesi koloni sayısının hafife alınmasına yol açabilir. Kalan bu çanakların her birinin koloni sayıları kaydedilir ve seyreltme faktörü ile çarpılırsa ve daha sonra kaplanan hacme bölünürse, bu, mililitre süspansiyon başına koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları verir. Bu videoda, bilinen bir bakteri içeren bir numuneyi ve bir Winogradsky Sütununun çeşitli bölgelerinde bulunan mikrobiyal toplulukları seri seyreltme, yayılmış kaplama ve çizgi kaplama yoluyla kalitatif ve kantitatif olarak nasıl değerlendireceğinizi öğreneceksiniz. İlk olarak, laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Ardından, çalışma alanını% 70 etanol ile sterilize edin ve yüzeyi silin. Ardından, iki adet 500 mililitrelik Erlenmeyer şişesi toplayın ve bir et suyunu ve diğerini agar olarak etiketleyin. LB agar solüsyonu hazırlamak için, agar etiketli şişede yaklaşık 6.25 gram LB agar, üç gram teknik agar ve 250 mililitre damıtılmış suyu karıştırın. Daha sonra 2'yi birleştirerek LB suyunu hazırlayın. Et suyu etiketli şişede 5 gram LB ortamı ve 100 mililitre damıtılmış su. Şişeleri otoklavladıktan sonra, şişeleri otoklavdan çıkarmak için ısıya dayanıklı bir eldiven kullanın ve 40 ila 50 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Şişeler 50 santigrat dereceye ulaştığında, et suyu çözeltisinin üç adet 100 mililitrelik alikotunu dikkatlice hazırlayın ve her bir alikot çözeltisini sıfır olarak etiketleyin. Daha sonra, 10 steril petri kabı toplayın ve bunları tarih, isim, kullanılan ortam türü ve organizmaların hasat edileceği Winogradsky Sütunu bölgesi ile etiketleyin. Agar şişesinden 15 mililitre agarı her bir petri kabına pipetleyin. Ardından, kabarcıkları çıkarmak için pipet ucunu kullanın, plaka kapaklarını yerine takın ve gece boyunca tezgah üstünde katılaşmalarına izin verin. Ertesi gün, tezgah üstünü %70 etanol ile silin. Ardından, 10 adet 20 mililitrelik test tüpünü T1'den T10'a kadar etiketleyin ve bir rafa yerleştirin. Her tüpe dokuz mililitre% .45 salin pipetleyin. Şimdi, 10 test tüpünün her birini kapaklarıyla gevşek bir şekilde kapatın ve bunları otoklav uyumlu bir test tüpü rafına aktarın. Döngü tamamlandıktan sonra, ısıya dayanıklı eldivenler kullanarak tuzlu su boşluklarını çıkarın ve soğumalarını bekleyin. Tüpleri yaklaşık 22 santigrat dereceye ulaşana kadar oda sıcaklığında saklayın. Bilinen bir hedef organizmayı yetiştirmek için, bu örnekte E. coli, daha önce çizgili bir plakadan tek bir koloni ile 100 mililitre çözelti sıfırını aşılayın. Ardından, tüpü örtün ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir Winogradsky Sütununun bölgelerini değerlendirmek için, aerobik bölgeden T1'e yaklaşık bir gram malzeme ekleyin ve girdaplama ile yeniden süspanse edin. Ardından, bu işlemi anaerobik bölgeden bir gram malzeme ile tekrarlayın. E. coli ile aşılanmış sıfır çözelti içeren tüpü inkübatörden çıkarın ve çalkalayın. Ardından, çözeltinin bir mililitresini bir T1 test tüpüne pipetleyin ve karıştırmak için girdap yapın. T1'den bir mililitre çözelti çıkarın ve karıştırmak için girdap yaparak T2'ye aktarın. Bu işlemi T10 tüpü ile tekrarlayın. Winogradsky Sütununun aerobik ve anaerobik bölgelerini değerlendirmek için, önceden hazırlanmış T1 tüplerinin her birinden bir mililitre çözelti çıkarın ve uygun T2 tüplerine aktarın. Ardından, daha önce gösterildiği gibi T10 tüplerinden seri seyreltmelere devam edin. Plakayı yaymak için, her bir T3 tüpünden 100 mikrolitre seyreltilmiş numuneyi ilgili petri kabına pipetleyin. Ardından, numuneyi petri kabına nazikçe dağıtmak için steril bir yayma çubuğu kullanın ve plaka kapağını değiştirin. Daha önce gösterildiği gibi T6 ve T9 dilüsyonları için bu işlemi tekrarlayın. Aerobik organizmalar içeren plakaları 37 santigrat derece inkübatörde 24 saat inkübe edin. Anaerobik organizmalar içeren plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış anaerobik bir odada inkübe edin. Ertesi gün T3, T6 ve T9 seyreltme plakalarını inkübatörden ve anaerobik odadan çıkarın ve tezgah üstüne aktarın. Her seferinde bir plaka ile çalışarak, steril bir aşılama halkasını ortamın üst kısmı boyunca zikzak şeklinde kaydırın. Ardından, petri kabı kapağını değiştirin. Ardından, plakayı 1/3 oranında döndürün ve önceden yapılmış zikzak deseninin frekansını azaltmak için halkayı sterilize edin. Yine ilmeği sterilize ettikten sonra plakayı 1/3 oranında döndürün, zikzak deseninin sıklığını son bir kez azaltın ve kapağı yerine takın. Daha önce gösterildiği gibi kalan plakalar için bu çizgi yöntemini tekrarlayın. Ardından, aerobik organizmalar içeren çizgili plakaları gece boyunca 37 santigrat derece inkübatöre ve anaerobik organizmalar içeren çizgili plakaları gece boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış anaerobik bir odaya yerleştirin. Kültürler, yedi günlük bir Winogradsky Sütunu'nun aerobik ve anaerobik bölgelerinden toplandı. Daha sonra kültürler, LB agar plakaları üzerinde çizgilenmeden ve yayılmadan önce seri olarak seyreltildi. Çizgi, değerlendirilen Winogradsky bölgelerinin her birinden karışık bir popülasyon ortaya çıkardı ve yayılma plakaları benzer sonuçlar verdi. Karışık bir popülasyondan çizgili bir plaka, farklı şekil, boyut, doku ve renklerde bakteri kolonileri ile sonuçlanacaktır. Buna karşılık, bilinen organizma olan E. coli'yi içeren çizgili ve yayılmış plakalar homolog bir popülasyon gösterdi. Genel olarak, aynı numune ve seyreltme faktörü ile yayılmış üç plakanın ortalama koloni sayısını kullanarak mililitre başına CFU'ları hesaplamak en iyisidir. Ortalama koloni sayısını seyreltme faktörü ile çarpın ve alıntılanan miktara bölün. Son olarak, her bir plakadan seçilen izole koloniler, tür kimliğini belirlemek için daha fazla zenginleştirme tahlillerinde kullanılabilir.

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

İleri Biyoloji

Microbiology

Mikrobiyoloji

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Bu koleksiyon, uygun steril teknik ve plaklama, selektif ortam kullanımı ve numunelerin güçlendirilmesi ve karışık veya saf numuneler için kültür yöntemleri de dahil olmak üzere mikrobiyolojik araştırmanın temel araçlarını göstermektedir. Ek olarak, mikrobiyal izolatları tanımlamada kullanılan yaygın yöntemlerin yanı sıra bakterilerin genetik manipülasyonu için prosedürleri de içerir.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

Description

Transcript

Tags