Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Louisiana Student Standards for Science

High School

Life Sciences

from-molecules-to-organisms-structures-and-processes

From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. Epsilometre testleri (E-testleri)
<ol>
	<li>Kurulum
	<ol>
		<li>Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin</li>
		<li>Çalışma alanını p etanol kullanarak sterilize ederek hazırlayın</li>
		<li>Mueller-Hinton agar plakalarını (MHA plakaları) toplayın</li>
	</ol>
	</li>
	<li>McFarland bulanıklık standardı No. 0.5'in hazırlanması
	<ol>
		<li>% 1'lik bir baryum klorür (BaCl2) çözeltisi hazırlayın: 
		100 mL damıtılmış suya 1 gram susuz baryum klorür (BaCl2) ekleyin. İyi girdap.</li>
		<li>% 1'lik bir sülfürik asit çözeltisi hazırlayın (H2S04): 
		99 mL damıtılmış suya 1 mL konsantre H2S04 ekleyin. İyi girdap.</li>
		<li>Bir McFarland bulanıklık standardı No. 0.5: hazırlayın
		5 mL% 1 H2 S04çözeltisi içinde 50 μL BaCl 2çözeltisi. Bulanık bir süspansiyon elde etmek için çözeltiyi iyice girdaplayın.</li>
		<li>McFarland bulanıklık standardı No. 0.5'i folyo kaplı bir tüpte tutun. 25°C'de en fazla 6 ay saklayın. Kullanmadan önce homojen bir çözeltiye iyice girdaplayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MHA plakalarının hazırlanması
	<ol>
		<li>Steril bir halka kullanarak Streptococcus grup G bakterilerini kan agar plakasından kazıyın. 1 mL tuzlu suya karıştırın ve bakteri süspansiyonuna girdap yapın.</li>
		<li>Deneyler sırasında aynı aşı boyutuna sahip olmak için aynı bulanıklığı elde etmek için süspansiyonu bir McFarland standardı No. 0.5 ile karşılaştırın. Ek tuzlu su veya bakteri kullanarak konsantrasyonu ayarlayın.</li>
		<li>Steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak MHA plakalarını aşılayın. Yüzeyi kaplamak için plakayı nazikçe sürün. Aşağıda açıklanan üç yöntemden biriyle devam edin (1.4-1.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tek antibiyotik direnç testi. Streptokok grup G, penisilin G veya gentamisine direnç
	<ol>
		<li>MHA plakasının ortasına bir E-test şeridi (penisilin G veya gentamisin) yerleştirin (Şekil 1 A,B).</li>
		<li>18-20 saat, 37°C'de inkübe edin.</li>
		<li>Sonuçları okuyun. MIC, dereceli antibiyotik test şeridini (Şekil 1 C,D) kesiştiren inhibisyon bölgesi olarak ölçülür.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> 
Şekil 1: Tek E-test. A) penisilin G ve B) gentamisin içeren bir E-test şeridinin, 37 ° C'de gece boyunca inkübasyondan önce (A ve B) ve sonra (C ve D) (C ve D) bir grup G streptokoklarının bakteri kolonileri ile kaplı bir Mueller Hinton agar plakasına yerleştirilmesi% 5 CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol ba>
	<li>Sinerji testi, çapraz yaklaşım. Streptokok grubu G, penisilin G ve gentamisine direnç.
	<ol>
		<li>Farklı antibiyotikler içeren iki E-test şeridi yerleştirin (ör. penisilin G ve gentamisin) aşılanmış MHA plakasına çapraz bir şekilde yerleştirin.
		<ol>
			<li>En doğru sonuçlar için, daha önce tek bir antibiyotik direnç testinde belirlenen MIC değerlerinde ölçekler arasındaki kesişme noktasında yaklaşık 90°'lik bir açıyla haçı yerleştirmeyi hedefleyin (Şekil 2 A).</li>
			<li>Şeritler agar plakasına yerleştirildikten sonra, bazı antibiyotikler plaka tarafından zaten emilmiş olabileceğinden, hareket ettirilmemeleri gerektiğini unutmayın. Bu nedenle, şeritleri biraz yanlış bir açıda (örn. 85°) ve gerçek MIC değerinden 1-2 mm'ye kadar tutmak daha uygundur. Bu sorunu azaltmak için denemeyi üç nüsha halinde çalıştırmanız önerilir.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>18-20 saat, 37°C'de inkübe edin.</li>
		<li>Sonuçları okuyun. MIC, her bir ilgili E-test şeridinde dereceli antibiyotik test şeridini kesen inhibisyon bölgesi olarak ölçülür (Şekil 2 B).</li>
		<li>Sinerjiyi belirlemek için fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) (Denklem 1) formülünü kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> 
Şekil 2: Sinerjizm tespiti - çapraz test. Penisilin G ve gentamisinin MIC'inin Streptococcus grup G'de (A) ve (B) inkübasyonundan önce ve sonra gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'de antimikrobiyal sinerji testinin sonuçları. İki ayrı MIC değeri arasında 90°'lik bir açı oluşur (penisilin G: 0.094 μg/mL, gentamisin: 8 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol ba>
	<li>Sinerji testi, çapraz olmayan yaklaşım. Streptokok grubu G, penisilin G ve gentamisine direnç.
	<ol>
		<li>E-test şeridini MHA plakasının ortasına yerleştirin (Şekil 3 A,D).</li>
		<li>Her şeritte önceden belirlenen MIC değerinin nerede olduğunu işaretleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Her MHA plakası için E-test şeridini atın (Şekil 3 B,E).</li>
		<li>İkinci E-test şeridini (farklı bir antibiyotik içeren) sırasıyla daha önce çıkarılan şeridin alanına, MIC değerleri işarete karşılık gelecek ve hizalanacak şekilde yerleştirin.</li>
		<li>18-20 saat, 37°C'de inkübe edin.</li>
		<li>Sonuçları okuyun. MIC, her bir E-test şeridinde dereceli antibiyotik test şeridini kesen inhibisyon bölgesi olarak ölçülür (Şekil 3 C,F).</li>
		<li>Sinerjiyi belirlemek için, fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) formülü kullanılır (Denklem 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> 
Şekil 3: Sinerjizm tespiti - çapraz olmayan test. Streptococcus grubu G'de penisilin G ve gentamisinin MİK antimikrobiyal sinerji testinin sonuçları. A) Streptococcus grubu G bakterilerinin üzerinde gentamisin şeridi (8 μg/mL merkezli), B) Gentamisin şeridinin çıkarılması, C) Streptococcus grubu G bakterilerinin üzerine kombine gentamisin / penisilin G şeridi (0.094 μg/mL merkezli), D) Penisilin G şeridi (0.094 μg/mL merkezli), E) Penisilin G şeridinin çıkarılması, F) Streptococcus grubu G bakterilerinin üzerine kombine penisilin G / gentamisin şeridi (8 μg/mL merkezli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Et suyu testi
<ol>
	<li>Kurulum
	<ol>
		<li>Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin</li>
		<li>Çalışma alanını p etanol kullanarak sterilize ederek hazırlayın</li>
		<li>% 50 parçalanmış at kanı ve 20 mg / mL β-NAD (MH-F) içeren 15 mL MH suyu toplayın</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Katı ortamda MIC'yi belirlemek için bir E-test [Protokol 1] gerçekleştirin
	<ol>
		<li>İsteğe bağlı olsa da, bu tür bir bilgi daha iyi deneysel tasarıma izin verecektir (örneğin, eklenen antibiyotik konsantrasyonları, plakadan belirlenen MIC değerini çevreleyecek şekilde tasarlanabilir), bu da başarılı bir deney şansını artırır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bakteriyel bir aşı hazırlamak. Yukarıda belirtildiği gibi, bakteri konsantrasyonu OD nm ölçümleri veya McFarland bulanıklık standartları ile tahmin edilebilir
	<ol>
		<li>OD600 nm Yöntemi
		<ol>
			<li>Belirlenmiş bir bakteri konsantrasyonuna sahip bir bakteri süspansiyonu elde edin</li>
			<li>0.003'lük bir OD600 elde etmek için kültürü MH-F suyunda seyreltin</li>
		</ol>
		</li>
		<li>McFarland bulanıklık yöntemi
		<ol>
			<li>15 mL MH-F suyunu steril bir tüpe koyun.</li>
			<li>MH-F suyunu bakterilerle (bir tabaktan) McFarland seviyesine kadar aşılayın. Çözeltiyi kuvvetlice girdaplayın. Çözeltiyi steril bir Petri kabına dökün.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Antibiyotik hazırlamak
	<ol>
		<li>İstenen antibiyotik konsantrasyonunu belirleyin
		<ol>
			<li>E-testinden MIC değerini tanımlayın (ör. penisilin G için 0.125 μg/mL ve gentamisin için 8 μg/mL)</li>
			<li>Agar plakası MIC değerini, dört-yedi 2x seri seyreltmeye karşılık gelen 24-2 7 ile çarpın. Bu, antibiyotiklerin başlangıç konsantrasyonu olacaktır. (ör. penisilin G için, yedi adet 2x seri dilüsyon: 0.125 μg/mL x 27 = 16 μg/mL; gentamisin için, dört adet 2x seri dilüsyon 8 μg/mL x 24 = 128 μg/mL</li>
			<li>Antibiyotiklerin stok konsantrasyonunu belirlemek için istenen başlangıç değerini 100x ile çarpın (örn. 1.6 mg / mL penisilin G ve 12.8 mg / mL gentamisin stokları)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Buna göre 100x antibiyotik stok konsantrasyonu hazırlayın
		<ol>
			<li>Antibiyotikleri 10 mL otoklavlanmış suda çözün ve bir stok çözeltisi oluşturmak için girdap yapın (ör. yukarıdaki stokları oluşturmak için 16 mg penisilin G ve 128 mg gentamisin)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroplaka kuyucuklarına bakteri ekleyin
	<ol>
		<li>Aliquot 200 μl MH-F suyu, üç parçalı bir deney için 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının ilk 3 sırasındaki kuyucuklara bakteri aşısı.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroplaka kuyucuklarına antibiyotik ekleyin
	<ol>
		<li>Toplam hacmi 400 μL'ye getirmek için kuyucukların ilk sütununa (A1, B1, C1) 200 μL ekstra MH-F suyu ekleyin.</li>
		<li>İlk kuyucuk sütununa 4 μL antibiyotik stok konsantrasyonu ekleyin. Numune 400 μL içerdiğinden, antibiyotiklerin 100 kat seyreltilmesine neden olacaktır.</li>
		<li>200 μL bakteri/antibiyotiği A1'den A2'ye, A11'e kadar aktararak 2x seri seyreltme oluşturun. Seyreltmeler arasında kuvvetlice pipetleyin. Ek satırlar için adımı yineleyin.</li>
		<li>Sütun 11'den 200 μL çıkarın, böylece tüm kuyucuklardaki nihai hacim 200 μL olur.</li>
		<li>Son sütunu (A12, B12, C12) kontrol olarak antibiyotiksiz bırakın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MIC değerlerini belirleyin
	<ol>
		<li>96 oyuklu mikrotitre plakasını çalkalamadan 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.</li>
		<li>MIC değeri, seyreltme serisinde görünür bakteri büyümesi göstermeyen son kuyucuk olarak tanımlanır (Şekil 4). Bununla birlikte, bu değere yalnızca orijinal aşı boyutunun doğru olması durumunda güvenilebilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> 
Şekil 4: Et suyu seyreltmesi ile MIC tayini. MIC burada, bulanıklığı değiştirmeden önce berraklık (bakteri üremesi olmayan) sergileyen son kuyu olarak tanımlanır. Satır, penisilin G'nin MIC değerinin kopyalarıdır ve satır, gentamisinin MIC değerinin kopyalarıdır, her ikisi de Streptococcus grubu G'nin bir izolatına karşıdır. A) gerçek deneysel sonuç, B) A'dan alınan değerlerin şematik yorumu (gri = büyüme yok; beyaz = büyüme). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> 
Şekil 5: Orijinal bakteri konsantrasyonunu saymak için seyreltme serisinin şematik prosedürü. Seyreltmeler tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (10x seyreltme serisi için 180 μL'de seyreltilmiş 20 μL) ve daha sonra AH sıralarından 10 μL, belirtildiği gibi iki ayrı kan agar plakası üzerine kaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol ba>
	<li>Orijinal aşı boyutunu belirleyin 
	not: Mikrobroth tahlilleri, kullanılan orijinal aşı boyutu için oldukça hassastır. Aşırı bir aşı boyutu yanlış pozitif sonuç verecektir, çünkü eklenen antibiyotikler bu oranda büyümeyi daha fazla engelleyemeyecektir. Bu nedenle, mikro kuyulara ne kadar bakteri eklendiğini doğrulamak çok önemlidir. Veriler deney noktasında mevcut olmayacak olsa da (24 saatlik inkübasyon ihtiyacı nedeniyle) bir kontrol görevi görecektir. Eklenen bakteri sayısı belirtilen konsantrasyon aralığındaysa, MIC değerlerine güvenilebilir. Aşı çok yüksek veya çok düşükse, deneyin tekrarlanması gerekir.
	<ol>
		<li>Bakterileri seri olarak seyreltin
		<ol>
			<li>İnokulum boyutunu belirlemek için orijinal bakteri konsantrasyonunu seyreltmek için 96 oyuklu bir mikrotitre plakası hazırlayın. Optimum, 105-6 bakteri ile 200 μL'lik bir hacimdir. Seyreltmeleri gerçekleştirmek için, önce BH'deki her bir oyuğa 180 μL steril PBS alikot edin (üç kopya 1-3 halinde).</li>
			<li>Daha sonra, A'ya 100 μl bakteri çözeltisi ekleyin (üçlü 1-3 halinde).</li>
			<li>20 μl bakteriyi A'dan B'ye kuvvetlice pipetleyerek 10x seri seyreltme (üç kopya halinde) oluşturun. CH için adımları tekrarlayın.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>İnokulum boyutunun belirlenmesi için bakteri dilüsyonlarını plakalayın
		<ol>
			<li>Kanlı agar plakalarını Şekil 5'e göre işaretleyin.</li>
			<li>Seri seyreltmeden 10 μL'yi Şekil 5'e göre plakaya aktarın.</li>
			<li>Plakayı 37°C'de 20-24 saat inkübe edin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bakteriyel aşı boyutunu belirleyin
		<ol>
			<li>5-50 koloni içindeki noktalardaki bakteri sayılarını sayın (Şekil 6).</li>
			<li>Üçlü numunelerin ortalamasını hesaplayarak ilk aşılama boyutunu hesaplayın, seyreltme faktörü ile çarpın (örn. B numuneleri için 10x, C numuneleri için 100x, D numuneleri için 1000x, vb.) ve ardından 10 μL'lik lekelenme hacmini telafi etmek için 100 ile çarpın, bu da cfu/mL cinsinden inokülum boyutu ile sonuçlanır. Aşı 105-6 cfu / mL içindeyse, MIC verilerine güvenilebilir.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> 
Şekil 6: İnokulum boyutunun belirlenmesi. Şekil 5'e göre aşılanan bakteriler 37 ° C'de 20-24 saat inkübe edildi ve daha sonra sayıldı. D satırında sayılacak çok sayıda koloni vardır (örneğin 5-50). A'daki numuneler seyreltilmemiştir, B 10 kat seyreltilir, C 100 kat seyreltilir ve D 1000 kez seyreltilir ve her noktada sadece 10 μL kaplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Antibiyotik direnci dünya çapında bir sağlık sorunudur. Mikropların direnç mekanizmalarını belirlemek için, farklı antibiyotiklerle sinerji ve antagonizma testi yapan yöntemler çok önemlidir. E-test yöntemi hızlıdır, kopyalanması kolaydır ve kombinasyon tedavilerinin herhangi bir sinerjik potansiyelini araştırmak için kullanılabilir. Et suyu seyreltme yöntemi, bakterisidal aktiviteyi tahmin etmek için de değerlendirilebilir. Farklı mikropların direnç mekanizmalarını araştırmak için sinerjistik ve antagonistik antibiyotik...

antibiyotik duyarlılık testi: İki antibiyotiğin mİk değerlerini belirlemek ve antibiyotik sinerjisini değerlendirmek için epsilometre testleri

Kaynak: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1 
1 Lund, Enfeksiyon Tıbbı Anabilim Dalı, Biyomedikal Merkezi, Lund Üniversitesi, 221 00 Lund İsveç
Antibiyotikler ve bakteriler arasındaki etkileşimlerin bilinmesi, mikropların antibiyotik direncini nasıl geliştirdiğini anlamada önemlidir. 1928'de Alexander Fleming, hücre duvarı yenilenmesine müdahale ederek antibakteriyel işlevini yerine getiren bir antibiyotik olan penisilini keşfetti (1). Bakterilerde DNA replikasyonunu ve protein translasyonunu inhibe eden ilaçlar da dahil olmak üzere çeşitli etki mekanizmalarına sahip diğer antibiyotikler daha sonra keşfedilmiştir; Ancak son yıllarda yeni bir antibiyotik geliştirilmemiştir. Mevcut antibiyotiklere direnç artmakta ve bu da etkili bir şekilde tedavi edilemeyen ciddi enfeksiyon hastalıklarına neden olmaktadır (2). Burada, bakteri popülasyonlarında antibiyotik direncini değerlendirmek için çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemlerin her biri, kullanılan antibiyotiklerin etki mekanizmasından bağımsız olarak işe yarar, çünkü bakteri ölümü ölçülen sonuçtur. Antibiyotik direnci sadece özellikle hastane ortamlarında değil, aynı zamanda toplum genelinde de hızla yayılmaktadır. Bu tür direnç araçlarını araştırmak için Epsilometre testi (E-testi) ve et suyu seyreltme testi dahil olmak üzere farklı yöntemler geliştirilmiştir (3). 
E-test iyi bilinen bir yöntemdir ve bir mikroorganizmanın görünür büyümesini engelleyen en düşük antimikrobiyal konsantrasyonu olan Minimal İnhibitör Konsantrasyon (MIC) verilerini ölçen uygun maliyetli bir araçtır. Kullanılan bakteri suşuna ve antibiyotiklere bağlı olarak, MİK değeri μg/mL'nin altında &gt;1000 μg/mL arasında değişebilir (4). E-testi, μg/mL cinsinden MIC okuma ölçeği ile basılmış, önceden tanımlanmış bir antibiyotik gradyanı içeren plastik bir şerit kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şerit, aşılanmış agar plakasına uygulandığında doğrudan agar matrisi üzerine aktarılır. İnkübasyondan sonra, bakteri üremesi önlendiği için şerit boyunca simetrik bir eliptik inhibisyon bölgesi görülebilir. MIC, elipsin şeritle kesiştiği son nokta olan inhibisyon alanı ile tanımlanır. MIC'yi belirlemek için başka bir yaygın yöntem, mikrobroth seyreltme yöntemidir. Mikrobrot seyreltmesi, aşılanmış bakteriler içeren bir et suyu ortamına eklenen antimikrobiyal ajanın farklı konsantrasyonlarını içerir. İnkübasyondan sonra MİK, gözle görülür büyümeyi önleyen en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak tanımlanır (5). Aynı zamanda kantitatif bir yöntemdir ve birkaç bakteriye uygulanabilir. Bu yöntemin dezavantajları, reaktiflerin konsantrasyonlarını hazırlarken hata olasılığını ve deney için gerekli olan çok sayıda reaktifi içerir. Antibiyotik direncinin ölçülmesi hem klinik hem de araştırma açısından zorunludur ve direnci araştırmak için bu in vitro yöntemleri aşağıda tartışılmış ve sergilenmiştir. 
Belirli bir bakteri için direnç profili, bir hastanın tek tedaviye karşı kombinasyon tedavisinden fayda sağlayıp sağlamayacağını belirlemek için antibiyotik tedavisini optimize etmek için uygulanabilir. Aynı anda birden fazla antibiyotiğin kullanımı için, birbirleriyle etkileşimlerini ve katkı maddesi, sinerjik veya antagonistik bir etkiye sahip olup olmadıklarını bilmek zorunludur. Antibiyotiklerin ortak etkisi, eşit dozda verilen bireysel antibiyotiklerin gücüne eşit olduğunda ilave bir etki görülebilir. Öte yandan, antibiyotikler arasındaki sinerji, antibiyotiklerin ortak etkisinin, ilacın tek başına verileceği duruma göre daha güçlü olduğu durumlarda ortaya çıkar (6). Antimikrobiyal tedavi kombinasyonlarının uygulanması, antimikrobiyal direncin oluşmasını önlemek ve böylece bireysel antibiyotik tedavisinin etkisini arttırmak için kullanılır (7). Antimikrobiyal kombinasyonların gereksiz kullanımını önlemek için antagonizma bilgisi de önemlidir. E-test metodolojisi, farklı antimikrobiyal ajanlar arasındaki olası sinerjiyi ve antagonizmayı belirlemek için basit ve çeşitli yollar sunar. Antibiyotiğe dirençli patojenlerin çoğalmasıyla yüzleşmek için, bazı antibiyotiklerin olası sinerjik ve antagonistik mekanizmalarının bilinmesi, klinik etkinlik ve çoklu ilaç direnciyle mücadele ile sonuçlanan önemlidir. 
E-testler kullanılarak sinerjinin belirlenmesi iki geniş yaklaşıma ayrılabilir: çapraz ve çapraz olmayan test. Her iki sinerji testi de bireysel MIC değerlerinin önceki bilgisine dayansa da, iki yaklaşım metodoloji ve kavramsal yaklaşım açısından biraz farklıdır. Çapraz olmayan bir sinerji testinde, test edilecek çiftteki ilk antibiyotik, bakterilerle aşılanmış bir agar plakasına yerleştirilir. İlk şeritten gelen antibiyotiklerin plakayı infüze etmesine izin verdikten sonra (örneğin 1 saat sonra), şerit çıkarılır ve ikinci antibiyotiği içeren yeni bir şerit, birinciyle tam olarak aynı yere yerleştirilir, bu da iki ayrı MIC değerini üst üste yerleştirdiğinizden emin olun. Elde edilen inhibisyon bölgesi daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi analiz edilebilir ve sinerji Denklem 1'e göre hesaplanabilir. 
Denklem 1 - Fraksiyonel İnhibitör Konsantrasyonlar (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
&gt;0.5 değerleri sinerjiyi gösterir. 
Sınav görevlisini analiz etmesi kolay plakalarla ödüllendirirken, şeritlerin değişmesinin yanı sıra deney başına iki plaka kullanma ihtiyacı nedeniyle yöntem biraz zahmetli ve zaman alıcıdır. Bunun yerine, genellikle bir çapraz test kullanılır. İki farklı E-test şeridini daha sonra üst üste eklemek yerine (birincisi çıkarıldıktan sonra), her ikisi de aynı anda ancak bir çapraz şeklinde (<img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg"> 90° açı) yerleştirilir ve daha önce belirlenen iki MIC değeri 90° açıyı oluşturur. Bu yaklaşımla, sinerji testi başına yalnızca bir plakaya ve daha az çalışmaya ihtiyaç duyulur, bu da analiz edilmesi biraz daha zor olmasına rağmen tercih edilen bir seçim haline getirir. Kombine antibiyotik yaklaşımındaki yeni MİK değerleri, modifiye edilmiş inhibisyon bölgeleri olarak görselleştirilebilir, daha sonra sinerji Denklem 1 ile belirlenebilir. 
Bir agar plakası yaklaşımı kullanmak yerine, daha yüksek esnekliği nedeniyle bir mikrobroth yaklaşımı genellikle tercih edilebilir (örneğin, bir E-test şeridinin sınırları dışında belirli antibiyotik konsantrasyonlarını seçme yeteneği). Ayrıca, mikrobroth testlerinin, antibiyotiklerin katı bir faz (agar plakası) içindeki ayrışmaya bağlı değil, sıvı bir çözelti içinde eşit dağılımı nedeniyle daha hassas olduğu önerilmektedir. 96 oyuklu bir mikroplakadaki kuyucuklar, belirli sayıda bakteri ile aşılanacaktır (106 cfu / mL: bakteri konsantrasyonu, OD600 nm ölçümleri, bulanıklık standartları veya 10x bakteri seri seyreltmesinden yayılmış kaplama numuneleri ile tahmin edilebilir) ve kuyucuklara farklı seyreltmelerde antibiyotikler eklenecektir. Benzer şekilde, E-test şeritlerine benzer şekilde, MIC, bakterilerin görünür büyümesini engelleyen en düşük antibiyotik konsantrasyonuna sahip kesişme noktası (kuyu / nokta) olarak belirlenir. 
Deneysel Amaç
<ul>
	<li>Aşağıdaki projede, Streptococcus grubu G'nin penisilin G ve gentamisinin MİK değerlerini E-test ve mikrobrot seyreltme olmak üzere iki farklı yöntemle belirleme stratejileri açıklanmaktadır. E-test için, Streptococcus grubu G ile aşılanmış Mueller-Hinton agar plakaları, penisilin G ve/veya gentamisinin gradyan şeritleri ile kombinasyon halinde kullanıldı; P parçalanmış at kanı içeren MH-suyu ve 20 mg/mL β-NAD ise çözünür antibiyotiklerle birlikte Streptococcus grubu G ile birlikte mikroet suyu yaklaşımında kullanıldı. </li>
</ul>
Malzemeler
<ul>
	<li>4°C</li>'de &lt;7 gün saklanan bir kan agar plakası üzerindeki bakteri kolonileri
	<li>Kanlı agar plakaları</li>
	<li>0.5 McFarland standardı
	<ul>
		<li>1% BaCl2</li>
		<li>1% H2SO4</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Tuzlu su tüpü (2 mL)</li>
	<li>Pamuk uçlu aplikatör</li>
	<li>Mueller-Hinton agar plakaları (MHA plakaları)</li>
	<li>P parçalanmış at kanı ve 20 mg/mL β-NAD (MH-F)</li> içeren MH suyu
	<li>E-test penisilin/gentamisin (veya ilgilenilen antibiyotikler) (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Fransa, İsveç)</li>
	<li>Antibiyotikler penisilin/gentamisin (veya ilgilenilen antibiyotikler (toz/solüsyon))</li>
</ul>
Not: Bakteri üremesi için kullanılan spesifik ortam, farklı türler için farklılık gösterebilir.

E-testindeki MIC değerleri 
Bireysel MİK değerleri Şekil 1'de penisilin G için 0.094 μg/mL ve gentamisin için 8 μg/mL olarak tanımlandı. Sinerji testleri için, her ikisi de penisilin G için 0.064 μg/mL'lik bir MİK değeri gösterdi (Şekil 2, 3), gentamisin çapraz ve çapraz olmayan testler için MIC 4 μg/mL'ye sahipti. Not: İki ayardaki şeritlerin farklı inkübasyon süreleri nedeniyle çapraz ve çapraz olmayan testler arasında hafif bir tutarsızlık ...

Antibiyotik Duyarlılık Testi: İki antibiyotiğin MİK değerlerini belirlemek ve antibiyotik sinerjisini değerlendirmek için epsilometre testleri

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

Antibiyotik duyarlılığı, bir bakterinin antibiyotiklere duyarlılığı olarak tanımlanır ve bir et suyu seyreltme testi veya E-testi olarak da adlandırılan bir Epsilometre testi kullanılarak ölçülebilir. Et suyu seyreltme yönteminde, seri antibiyotik dilüsyonları içeren bir büyüme ortamına standardize edilmiş sayıda bakteri eklenir. Duyarlıysa, bakteriler daha yüksek antibiyotik konsantrasyonlarında büyüyemez, ancak daha düşük antibiyotik konsantrasyonlarında çoğalmaya devam eder ve ortamın bulanıklaşmasına neden olur. Bakterilerin artık hayatta kalamayacağı veya çoğalamayacağı en düşük antibiyotik konsantrasyonu, verilen bakteri için antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonu veya MIC değeri olarak adlandırılır. Bir E-testinde, önceden tanımlanmış bir antibiyotik gradyanı ile emprenye edilmiş plastik bir şerit, bir Mueller-Hinton agar veya MH-A, Petri plakası üzerine yeni yayılmış bir bakteri çimi üzerine uygulanır. Antibiyotik, bakteriler tarafından alındığı agar ortamına yayılır. Duyarlıysa, bakteriler çoğalamaz ve ölür, E-şeridin etrafında büyüme engelleme bölgesi olarak adlandırılan net bir bölge oluşturur. Büyümenin E-şerit ile kesiştiği noktada, ölçekteki karşılık gelen değer antibiyotiğin MIC değerini verir. Genellikle antibiyotikler, antibiyotiğe dirençli bakteri suşlarının ortaya çıkmasını önlemek için kombinasyon halinde kullanılır. Bu genellikle katkı maddesinden ziyade sinerjik bir etki ile sonuçlanır. Sinerjik, iki antibiyotiğin birleşik etkisinin, bireysel aktivitelerinin toplamından daha büyük olduğu anlamına gelir. Bununla birlikte, etki yalnızca antibiyotik kombinasyonunun MIC değeri en az iki kat azaldığında önemli kabul edilir. Bu kriter, fraksiyonel inhibitör konsantrasyon veya FIC indeksi hesaplanarak değerlendirilir. Her bir antibiyotiğin MİK oranını her bir antibiyotiğin MİK ile kombinasyon halinde ayrı ayrı toplayarak, 0.5'ten küçük bir FIC indeksi sinerjiyi gösterir. Antibiyotik sinerjisi iki E-test tabanlı yöntem kullanılarak ölçülebilir: çapraz olmayan test veya çapraz test. Çapraz olmayan bir testte, ilk olarak, önceden belirlenmiş MIC değerlerine sahip iki farklı antibiyotik için E-şeritler iki ayrı plakaya uygulanır. Antibiyotikler ortama yayıldıktan sonra, orijinal E-şeritleri çıkarılır ve alternatif antibiyotikler için E-şeritleri, MIC ölçekleri tam olarak önceki şeritlerin MIC ölçeklerinin üzerine gelecek şekilde yerleştirilir. Çapraz olmayan testin daha hızlı bir versiyonu olan çapraz testte, iki antibiyotiğin E-şeritleri, MIC işaretlerinin ölçekleri kesişme noktasında 90 derecelik bir açı oluşturacak şekilde çapraz bir oluşumda bir araya getirilir. Her iki teknikte de inkübasyondan sonra, her bir antibiyotiğin diğer antibiyotikle kombinasyon halinde MIC değeri, büyüme inhibisyon bölgesinin E-şeridin kenarı ile kesiştiği noktada okunur. Ardından, FIC endeksi hesaplanır. Bu video, bir E-testi ve bir mikro et suyu seyreltme testi kullanarak belirli bir bakteri için belirli bir antibiyotiğin MIC değerinin nasıl belirleneceğini gösterecektir. Ayrıca, çapraz test ve çapraz olmayan test kullanarak iki antibiyotik arasındaki sinerjiyi nasıl belirleyeceğinizi de öğreneceksiniz. Başlamak için, laboratuvar eldivenleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Ardından, çalışma alanını% 70 etanol kullanarak sterilize edin. Daha sonra,% 50 parçalanmış at kanı ve mililitre beta-nikotinamid başına 20 miligram içeren 15 mililitre steril Mueller-Hinton suyu toplayın. Ve beş ila sekiz Mueller-Hinton agar plakası. Şimdi, 0.5 numaralı bir McFarland bulanıklık standardı hazırlamak için 9.95 mililitre% 1 sülfürik asit çözeltisi ölçün. Ardından, sülfürik asit çözeltisine 50 mikrolitre% 1 baryum klorür çözeltisi ekleyin. Bulanık bir süspansiyon elde etmek için çözeltiyi iyice vorteksleyin. Tüpü alüminyum folyo ile örtün ve bir kenara koyun. Daha sonra, bir mililitre salin solüsyonunu 15 mililitrelik bir tüpe dağıtın. Bakteriyel test plakanızdan bakteri üremesinin bir örneğini kazımak için steril bir halka kullanın, burada, Streptococcus grubu G. Ardından, bakteri yüklü halkayı tuzlu su çözeltisine yerleştirin, hafifçe karıştırın ve ardından tüpü iyice girdaplayın. Şimdi, bakteriyel süspansiyonu ve McFarland bulanıklık standartlarını yan yana yerleştirin ve bulanıklık eşdeğeri için karşılaştırın. Bakteriyel süspansiyonun bulanıklığı standartla eşleşene kadar ilave tuzlu su veya bakteri kolonileri ekleyin. İstenilen bulanıklık elde edildikten sonra, steril bir pamuk uçlu aplikatörü bakteri süspansiyonuna batırın. MH-A plakasını aşılamak için, plakanın tüm yüzeyini zikzak hareketiyle nazikçe sürün. Ardından, plakaların alt taraflarını bakteri adı ve tarih ile etiketleyin. Başlamak için, forseps ile kenarından tutarak bir penisilin G E-test şeridi çıkarın. Şeridi nazikçe yeni alınmış MH-A plakasının ortasına yerleştirin ve kapağı yerine yerleştirin. Bu örnekte, ikinci bir antibiyotik olan gentamisin de test edilmiştir. Böylece ikinci plaka ve bir gentamisin E-test şeridi ile şerit yerleştirme işlemi tekrarlanır. E-testin sonuçlarını belirlemek için, penisilin G E-test şeridini içeren ilk plakayı toplayın. Şimdi, inhibisyon bölgesinin antibiyotik şeridi ile kesiştiği noktayı belirleyin. Ölçekteki ilgili sayısal değeri okuyun. Bu değer, penisilin G'nin MIC değerini temsil eder. Gentamisin için MIC değerini de aynı şekilde belirleyin. Başlamak için, bir MH-A plakasını Streptococcus grubu G suşu bakterileri ile aşılayın. Plakanın altını bakterinin adı, kullanılacak antibiyotikler ve tarih ile etiketleyin. Şimdi, plakanın ortasına ilgilenilen antibiyotik için bir E-test şeridi yerleştirin. Ardından, ikinci test şeridini birinci şeride 90 derecelik bir açıyla tutun ve MIC işaretini bulun. İkinci E-şeridi, iki MIC değerinin kesiştiği noktada nazikçe birincinin üzerine yerleştirin. Şeritler yerleştirildikten sonra hareket ettirmeyin. Daha sonra, plakaları 18 ila 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki MH-A plakasını Streptococcus grubu G suş bakterileri ile aşıladıktan sonra, bir plakanın yüzeyine bir antibiyotik için bir E-test şeridi yerleştirin. Ardından, gösterildiği gibi ikinci plakaya diğer antibiyotik için bir E-test şeridi yerleştirin. Plastik bir aşılama halkası kullanarak, her bir antibiyotiğin MIC değerini ilgili plakasının yüzeyinde işaretleyin. Daha sonra, plakaları örtün ve bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bundan sonra, E şeritlerini çıkarmak için forseps kullanın. Ardından, plakalardan birini ve diğer antibiyotik için bir E-test şeridi toplayın. E-test şeridini ilk şeridin solundaki baskının üzerinde tutun ve E şeridindeki MIC değerinin işaretli çizgiyle hizalandığı noktayı bulun. Şeridi yavaşça bu kesişme noktasına yerleştirin. Bu işlemi ikinci plaka için tekrarlayın ve her iki plakayı da 37 santigrat derecede 18 ila 20 saat inkübe edin. İlk olarak, belirlenmiş bir bakteri konsantrasyonuna sahip bir bakteri süspansiyonu elde edin ve 0.003'lük bir OD600 elde etmek için kültürü MHF suyu içinde seyreltin. Daha sonra, 16 miligram penisilin G ve 128 miligram gentamisin tartın. Tartılan her kuru antibiyotiği 215 mililitrelik konik tüplere aktarın. Konik tüplerin her birine 10 mililitre damıtılmış su ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. Tüpleri antibiyotik adı ve konsantrasyonu ile etiketleyin. Tahlili üç kopya halinde gerçekleştirerek, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının üç sırasının ilk oyuklarına 400 mikrolitre çalışan bakteri çözeltisi ekleyin. Daha sonra, MHF suyunda 200 mikrolitre çalışan bakteri çözeltisini, üç sıranın kuyucuklarına ekleyin. Şimdi, iki katlı bir seri antibiyotik seyreltmesi oluşturmak için, önce ilk oyuğa dört mikrolitre antibiyotik stoğu ekleyin ve 100 kat seyreltme oluşturun. Sırayla, her sırada ilk kuyudan başlayarak ikinci kuyuya ve son oyuğa kadar her kuyucuğa 200 mikrolitre bakteri-antibiyotik solüsyonu aktarın, her transferden sonra iki ila üç kez pipetleyerek uygun şekilde karıştırıldığından emin olun. Son 200 mikrolitre bakteri-antibiyotik solüsyonunu atın. Penisilin G için et suyu mikro seyreltme testinin sonuçlarını belirlemek için, önce bulanıklık eksikliği ile gösterilen, görünür bakteri üremesi göstermeyen kuyucukları bulun. Bu kuyulardan, en düşük antibiyotik konsantrasyonuna sahip kuyuyu belirleyin. Bu, test edilen bakteriler için penisilin G'nin MIC değerini temsil eder. Gentamisinin MİK değeri aynı tahlil ve teknik kullanılarak belirlenebilir. Çapraz olmayan testin sonuçlarını belirlemek için, bir penisilin G E şeridi içeren ilk plakayı toplayın. Ardından, büyüme inhibisyon bölgesinin antibiyotik şeridi ile kesiştiği noktayı belirleyin. Ölçekteki karşılık gelen değer, gentamisin ile kombinasyon halinde penisilin G için MIC değerini temsil eder. Bu örnekte, kombinasyon halindeki MIC değeri mililitre başına 0.064 mikrogramdır. Şimdi, gentamisin E şeridini içeren ikinci plakayı toplayın ve daha önce gösterildiği gibi kombinasyon halinde MIC değerini belirleyin. Kombinasyonun etkisini değerlendirmek için, önce MIC'yi kombinasyon halinde tek başına antibiyotiğin MIC'ine bölerek penisilin G için fraksiyonel inhibitör konsantrasyonu veya FIC'yi hesaplayın. Gentamisin için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, burada gösterilen denklemi kullanarak FIC endeksini hesaplayın. Kombinasyon halinde MIC değerinde iki kat azalma, 0,5'e eşit veya daha küçük bir FIC indeks değeri verir ve penisilin G ile gentamisin arasındaki sinerjiyi gösterir. Bu durumda, hesaplanan FIC değeri 0,5'ten büyük olan 1,18'dir. Bu nedenle, sonuçlar penisilin G ve gentamisin arasında Streptococcus grubu G suşuna karşı sinerji göstermemektedir. Çapraz testin sonuçlarını belirlemek için, önce büyüme inhibisyon bölgelerinin ilgili E şeritleri ile kesiştiği noktayı belirleyin. Bu kesişme noktasına karşılık gelen her bir E-test şeridindeki sayısal değeri okuyun. Bu değerler, penisilin G ve gentamisin için kombinasyon halinde MIC değerini temsil eder. Ardından, kombinasyonun etkisini değerlendirmek için burada gösterilen denklemi kullanarak FIC indeksini hesaplayın. Bu örnekte, hesaplanan FIC değeri 1,18'dir ve bu değer 0,5'ten büyüktür. Bu, penisilin G ve gentamisinin Streptococcus grubu G suşuna karşı sinerjik olarak hareket etmediği anlamına gelir.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

İleri Biyoloji

Microbiology

Mikrobiyoloji

measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

measuring-bacterial-resistance-with-e-tests

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Bu koleksiyon, uygun steril teknik ve plaklama, selektif ortam kullanımı ve numunelerin güçlendirilmesi ve karışık veya saf numuneler için kültür yöntemleri de dahil olmak üzere mikrobiyolojik araştırmanın temel araçlarını göstermektedir. Ek olarak, mikrobiyal izolatları tanımlamada kullanılan yaygın yöntemlerin yanı sıra bakterilerin genetik manipülasyonu için prosedürleri de içerir.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
...

Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

https://cloudfront.jove.com/files/media/science-education/science-education-thumbs/10647.jpg

Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Homeostatic Imbalance

Homeostasis is the maintenance of a stable internal environment within the body, which is crucial for the proper functioning of cells, tissues, organs, ...

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards