Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Bu protokol, kalsiyum klorür prosedürünün bir adaptasyonu kullanılarak yetkin E. coli DH5α'nın hazırlanmasını ve dönüştürülmesini açıklar (12).
1. Kurulum
<ol>
	<li>ekipman
	<ul>
		<li>Spektrofotometre</li>
		<li>Sorval Santrifüj (veya eşdeğeri)</li>
		<li>Tezgah üstü santrifüj</li>
		<li>Isı bloğu veya su banyosu</li>
		<li>Yörünge Çalkalayıcı</li>
		<li>Sabit İnkübatör</li>
		<li>Jel döküm tepsisi</li>
		<li>Kuyu tarakları</li>
		<li>Gerilim kaynağı</li>
		<li>Jel kutusu</li>
		<li>UV ışık kaynağı</li>
		<li>mikrodalga</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Çözeltiler ve reaktifler
	<ul>
		<li>Luria-Bertani (LB) suyu (10 g kazein enzimik hidrolizat, 5 g maya özütü ve 1000 mL H2O içinde 5 g sodyum klorür)</li>
		<li>Katabolit baskılanmış (SOC) Süper Optimal et suyu: (% 2 (a / h) tripton,% 0.5 (a / h) maya özütü, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04 ve 20 mM glikoz)</li>
		<li>CaCl2-MgCl 2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) çözeltisi.</li>
		<li>M CaCl2 çözeltisi (hücreler hemen dönüştürülecekse) veya (h / h) gliserol içeren 0.1M CaCl2 çözeltisi (hücreler ileride kullanılmak üzere dondurulacaksa).</li>
		<li>LB agar plakaları</li>
		<li>LB agar seçici plakalar (bu deney için, kullanılan plazmit ampisilin direnci sağladığından, 100 μg/mL ampisilin içeren LB agar plakaları kullanıldı)</li>
		<li>E. coli DH5α suşu</li>
		<li>Plazmid pUC19 DNA'sı (100 pg/ μl)</li>
		<li>QIAprep Spin Miniprep Kiti (Qiagen)</li>
		<li>HindIII kısıtlama enzimi</li>
		<li>1 kb artı DNA merdiveni</li>
		<li>Düşük Erime Noktalı Agaroz</li>
		<li>1X TAE tamponu (40 mM Tris Baz, 20 mM Asetik Asit ve 1mM EDTA)</li>
		<li>Etidiyum Bromür (10mg/mL)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Genel güvenlik notları 
	E. coli DH5α, Biyogüvenlik Seviyesi 1 (BSL1) olarak sınıflandırılır. Bu kategorideki mikroplar, sağlıklı yetişkinlerde enfeksiyon tehdidi çok azdır veya hiç yoktur. Bununla birlikte, mikroorganizmanın dikkatli bir şekilde manipüle edilmesi gerekir.</li>
</ol>
ÖNEMLİ Bu protokoldeki tüm adımların, aksi belirtilmedikçe aseptik teknikler kullanılarak ve buz veya 4°C sıcaklıklarda gerçekleştirilmesi gerekir.
2. Protokol
<ol>
	<li>Donmuş bir E. coli DH5α stoğundan (LB'de yetiştirilen bir gece kültüründen% 20 gliserol içinde dondurulmuş), bir LB agar plakasında izolasyon için bakterileri çizgilendirin. Gece boyunca 37°C'de (16-20 saat) inkübe edin.</li>
	<li>Tek bir koloniyi bir tüpte 3 mL LB suyuna aşılayın. Gece boyunca (16-20 saat) 37 ° C'de 210 rpm'de sallayarak büyüyün.</li>
	<li>Gece kültürünün OD600'ünü ölçün. 1 litrelik bir şişede 100 mL LB suyunu bir OD600=0.01'e aşılamak için gece kültürünü kullanın. Kültür OD600=0.35'e (yaklaşık 3 saat) ulaşana kadar her 15-20 dakikada bir spektrofotometrede OD600'ü izleyerek 37 ° C'de kuvvetli bir şekilde çalkalayarak (210 rpm) inkübe edin. 
	NOT: Dönüşümün verimli olması için bakteri hücrelerinin orta üstel büyüme aşamasında olması gerekir. Maksimum hücre sayısının 108 hücre / mL olması gerekir, bu da çoğu E. coli suşu için OD600=0.4'e karşılık gelir. Spektrofotometrenin kullanılması, hücrelerin uygun büyüme aşamasında olduğunu belirlemeye izin veren OD600'ün ölçülmesine izin verir. Bu protokol diğer bakteri türleri için kullanılacaksa, bu korelasyonu belirlemek için belirli OD600 değerlerinde birim oluşturan kolonilerin sayısını belirlemek için kalibrasyon gerekli olacaktır.</li>
	<li>Kültürün 50 mL'sini 2 buz gibi soğuk polipropilen santrifüj şişesinin her birine aktarın. Şişeleri soğuması için 20 dakika buzun üzerine koyun.</li>
	<li>Hücreleri 2700 g'da (bir Sorval GSA rotorunda 4100 rpm) 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleme ile geri kazanın.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın. Şişeyi bir ped veya kağıt havlu üzerine baş aşağı yerleştirerek son ortam izlerini boşaltın.</li>
	<li>Her bakteri peletini 30 mL CaCl2-MgCl 2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) buz gibi soğuk çözeltiye yeniden süspanse edin. Önce 5 mL çözelti ekleyin, pelet tamamen eriyene kadar dikkatlice döndürün ve ardından kalan 25 mL çözeltiyi ekleyin.</li>
	<li>Adım 2.4'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Adım 2.5'i tekrarlayın.</li>
	<li>Yetkili hücreler doğrudan dönüştürülecekse, tüpleri dikkatlice döndürerek her bir bakteri peletini 2 mLCaCl 2 (0.1 M) buz gibi soğuk bir çözeltiye yeniden süspanse edin. Pelet bu yöntemle yeniden süspanse edilmezse, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek (kabarcık oluşumunu önleyerek) yeniden süspanse edin. 
	Alternatif olarak, yetkili hücreler dondurulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Yetkili hücrelerin donmuş stoklarını hazırlamak için, peleti (h/h) gliserol içeren 0.1MCaCl 2 çözeltisinin 2 ml'sinde yeniden süspanse edin. Bu çözümün buz gibi soğuk olması gerekiyor. Buz gibi soğuk 1.5 mL polipropilen tüplere (tüp başına 160 μl) aliquot hücre süspansiyonu. Yetkili hücreleri hemen kuru bir buz/etanol banyosunda dondurun. Tüpleri -70°C'lik bir dondurucuya aktarın.</li>
	<li>CaCl2 ile muamele edilmiş hücreleri dönüştürmek için, 2 adet 1.5 ml'lik polipropilen tüpün her birine 50 μl yetkin hücre aktarın. 1 μl (100 pg) pUC19 plazmit DNA'sını tüplerden birine ekleyin ve ikinci tüpü DNA'sız bırakın (negatif kontrol). Yavaşça karıştırın (kabarcık oluşumunu önleyin). Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 
	NOT: Dönüşümde 10 μL veya daha az bir hacimde 50 ng'den fazla DNA kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Tüpleri ısı bloğuna aktarın ve tam olarak 45 saniye boyunca 42°C'de inkübe edin. 
	NOT: Isı şoku kritik bir adımdır. Sıcaklığı veya inkübasyon süresini aşmayın.</li>
	<li>Tüpleri kolayca buza aktarın. 2 dakika inkübe edin.</li>
	<li>950 μL SOC ortamı ekleyin ve bakterilerin iyileşmesine ve plazmidde kodlanan antibiyotiğe dirençli belirteçin eksprese edilmesine izin vermek için tüpleri 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>SOC'de 1000 μL'de hücre süspansiyonunun 10 μL'sini (1/100 seyreltme) ve hücre süspansiyonunun 100 μL'sini SOC'de (1/10 seyreltme) 1000 μL'de seyreltin. 100 μl seyreltme ve kontrol kısmını seçici plakalara plakalayın ve bir spatula kullanarak yayın. Genellikle, 1/100 ve 1/10 seyreltmenin 100 μL'sinin kaplanması, plaka başına yeterli sayıda koloni oluşturan birim (cfu) verecektir. İdeal olarak, bu sayı 30-300 cfu arasında değişmelidir, böylece yeterli koloni vardır, ancak birbirinden ayrılır. Bununla birlikte, cfu sayısı dönüşüm verimliliğine bağlı olacaktır (Veri Analizi ve Sonuçlar Bölümüne bakınız).</li>
	<li>Plakaları 37 ° C'de inkübe edin. Dönüştürülmüş koloniler 12-16 saat içinde ortaya çıkmalıdır (bu aralık hücre suşuna ve seçim yöntemine bağlı olacaktır). Negatif kontrolde hiçbir koloni büyümemelidir.</li>
	<li>Dönüşüm için elde edilen kob/plakayı sayın (Tablo 1).</li>
	<li>Transformatörlerin pUC19 plazmidini barındırdığını doğrulamak için, bir plazmit hazırlığı ve ardından sindirim gerçekleştirilecektir. Bu amaçla, tek bir koloniyi bir tüpte 3 ml LB suyuna aşılayın. Gece boyunca (16-20 saat) 37 ° C'de 210 rpm'de sallayarak büyüyün.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre QIAprep Spin Miniprep Kitini kullanarak bir plazmid preparatı hazırlayın.</li>
	<li>1 μg saflaştırılmış pUC19'u kısıtlama enzimi HindIII ile 37 ° C'de 1 saat boyunca sindirin. 
	NOT: pUC19 çoklu klonlama bölgesini kesen herhangi bir enzim bu adım için kullanılabilir.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="her zaman">
	<tbody>
		<tr>
			<td>parça</td>
			<td>miktar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Kısıtlama özet arabelleği</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plazmid pUC19</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>20,5 μl (25 μl'ye kadar)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol ba>
	<li>1 μg/mL etidyum bromür içeren %1'lik bir agaroz jel içinde 95 V. 'de 1 saat boyunca bir moleküler ağırlık merdiveni, sindirilmiş pUC19 DNA'sı ve aynı miktarda sindirilmemiş pUC19 DNA'sı çalıştırın
	NOT: zaman ve voltaj, kullanılan ekipmana bağlı olarak değişecektir.</li>
	<li>Jeli UV ışığı altında görselleştirin. Sindirilmiş ve sindirilmemiş pUC19 DNA'sının boyutunu karşılaştırın (Şekil 2) (Veri Analizi ve Sonuçlar Bölümüne bakınız). 
	Her bir dönüştürme deneyinin hedefine göre dönüştürmeyi doğrulamak için gereken gerekli adımlarla devam edin.</li>
</ol>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> 
Şekil 2: Transforme DH5α hücrelerinden geri kazanılan plazmit DNA'nın sindirimi. Plazmid DNA, transforme edilmiş DH5α hücrelerinden geri kazanıldı, HindIII ile sindirildi,% 1'lik bir agaroz jel içinde çalıştırıldı ve bir UV kaynağı ile görüntülendi (aşama 2.19 ila 2.22).
3. Veri Analizi ve Sonuçlar
Hücrelerin hücre dışı DNA'yı ne kadar iyi aldığının bir göstergesi olan dönüşüm verimliliğini hesaplamak için, dönüşümde elde edilen kolonilerin sayılması gerekir:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="her zaman">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Seyreltme</td>
			<td>Eczacılık</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Dönüşüm deneyinden sayılan koloni oluşturan birimler (cfu).
Dönüşüm verimliliği (TE), 1 μg plazmitin belirli bir yetkin hücre hacmine dönüştürülmesinden kaynaklanan cfu sayısının bir ölçüsüdür. Birçok parametre dönüşüm verimliliğini etkiler: plazmit boyutu, hücre genotipi, yeterlilik hazırlığı sırasında büyüme aşaması, dönüşüm yöntemleri, vb.). TE'yi hesaplarken, kaplamadan önce hangi seyreltmenin (varsa) yapıldığını dikkate almak ve bunu toplam cfu sayısının hesaplanmasına dahil etmek önemlidir. Dönüşüm verimliliği (TE) aşağıdaki denklemle hesaplanır:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
Önce cfu'yu DNA'nın μg'sine bölün, bu örnekte 0.0001μg. Ardından sonucu seyreltme faktörüne bölün. Bu örnekte, 1/10'luk bir seyreltme kullanılmış ve 100μL'lik 1 ml'lik bir çözelti kaplanmıştır (seyreltme: 1/10 × 100 μL /1000 μL=0.01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

Dönüşüm, laboratuvardaki birçok moleküler biyoloji uygulamasının anahtarı olan bakteri hücrelerine eksojen DNA sokmak için güçlü bir yöntemdir. Ek olarak, bakteri hücrelerinin, artan genetik varyasyonla sonuçlanabilecek ve çok çeşitli koşullar altında hayatta kalmak için farklı faydalı özelliklerin kazanılmasına izin verebilecek genetik materyal alışverişine izin vererek doğada önemli bir rol oynar. Birçok bakteri türü, doğal yeterlilik için gerekli genleri kodlar. Bununla birlikte, bu genlerin indüklendiği koşullar hala...

uyarlanmış bir kalsiyum klorür prosedürü kullanılarak e. coli hücrelerinin dönüşümü

Kaynak: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1 ve Victor J. DiRita1 
1 Michigan State Üniversitesi, Mikrobiyoloji ve Moleküler Genetik Bölümü
Bakteriler, yatay gen transferi olarak bilinen bir süreçte genetik materyali (DeoksiriboNükleik Asit, DNA) değiş tokuş etme yeteneğine sahiptir. Eksojen DNA'nın dahil edilmesi, bakterilerin antibiyotiklerin veya antikorların (1) veya doğal habitatlarda bulunan moleküllerin (2) varlığı gibi değişen çevresel koşullara uyum sağlamalarına izin veren yeni genetik özellikler kazanabilecekleri bir mekanizma sağlar. Yatay gen transferinin üç mekanizması vardır: transformasyon, transdüksiyon ve konjugasyon (3). Burada dönüşüme, bakterilerin çevreden serbest DNA alma yeteneğine odaklanacağız. Laboratuvarda, dönüşüm sürecinin dört genel adımı vardır: 1) Yetkin hücrelerin hazırlanması, 2) Yetkin hücrelerin DNA ile inkübasyonu, 3) Hücrelerin geri kazanılması ve 4) Transformantların büyümesi için hücrelerin kaplanması (Şekil 1). 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> 
Şekil 1: Dönüşüm sürecinin genel adımları. Dönüşüm sürecinin dört genel adımı vardır: 1) Yetkin hücrelerin hazırlanması, 2) DNA ile inkübasyon, 3) Hücrelerin geri kazanılması ve 4) Dönüştürücülerin büyümesi için hücrelerin kaplanması. 
Dönüşümün gerçekleşmesi için, alıcı bakterinin yeterlilik olarak bilinen bir durumda olması gerekir. Bazı bakteriler, belirli çevresel koşullara tepki olarak doğal olarak yetkin hale gelme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, diğer birçok bakteri doğal olarak yetkin hale gelmez veya bu işlemin koşulları henüz bilinmemektedir. DNA'yı bakterilere sokma yeteneğinin bir dizi araştırma uygulaması vardır: ilgilenilen bir DNA molekülünün birden fazla kopyasını oluşturmak, klonlama prosedürlerinde bir bileşen olarak büyük miktarda proteini ifade etmek ve diğerleri. Moleküler biyolojiye dönüşümün değeri nedeniyle, doğal yeterlilik koşulları bilinmediğinde hücreleri yapay olarak yetkin hale getirmeyi amaçlayan çeşitli protokoller vardır. Yapay olarak yetkin hücreler hazırlamak için iki ana yöntem kullanılır: 1) hücrelerin kimyasal olarak işlenmesi ve 2) hücrelerin elektrik darbelerine maruz bırakılması (elektroporasyon). İlki, DNA ile hücre yüzeyi arasında çekim yaratma prosedürüne bağlı olarak farklı kimyasallar kullanırken, ikincisi, bakteri hücre zarında DNA moleküllerinin girebileceği gözenekler oluşturmak için elektrik alanları kullanır. Kimyasal yeterlilik için en verimli yaklaşım, iki değerlikli katyonlarla, özellikle de kalsiyum (Ca2+) (4,5) ile inkübasyondur. Kalsiyum kaynaklı yeterlilik burada açıklanacak prosedürdür (6). Bu yöntem esas olarak Gram-negatif bakterilerin dönüşümü için kullanılır ve bu protokolün odak noktası olacaktır. 
Kimyasal dönüşüm prosedürü, hücrelerin kimyasal yeterliliği indüklemek için katyonlara maruz bırakıldığı bir dizi adımı içerir. Bu adımları daha sonra, yabancı DNA'nın yetkili hücre tarafından alınmasını destekleyen bir sıcaklık değişimi - ısı şoku - takip eder (7). Bakteri hücre zarfları negatif yüklüdür. Escherichia coli gibi Gram negatif bakterilerde, lipopolisakkarit (LPS) (8) varlığına bağlı olarak dış zar negatif yüklüdür. Bu, benzer şekilde negatif yüklü DNA moleküllerinin itilmesine neden olur. Kimyasal yeterlilik indüksiyonunda, pozitif yüklü kalsiyum iyonları bu yük itmesini nötralize ederek DNA'nın hücre yüzeyine emilimini sağlar (9). Kalsiyum tedavisi ve DNA ile inkübasyon buz üzerinde yapılır. Daha sonra, daha yüksek sıcaklıklarda (42 ° C) bir inkübasyon, ısı şoku gerçekleştirilir. Bu sıcaklık dengesizliği DNA alımını daha da destekler. Bakteri hücrelerinin, ısı şoku tedavisine dayanabilmesi için orta üstel büyüme aşamasında olması gerekir; Diğer büyüme aşamalarında, bakteri hücreleri ısıya karşı çok hassastır ve bu da canlılık kaybına neden olur ve bu da dönüşüm verimliliğini önemli ölçüde azaltır. 
Transformasyon için farklı DNA kaynakları kullanılabilir. Tipik olarak, plazmitler, küçük dairesel, çift sarmallı DNA molekülleri, E. coli'deki çoğu laboratuvar prosedüründe dönüşüm için kullanılır. Plazmitlerin transformasyondan sonra bakteri hücresinde muhafaza edilebilmesi için, bir replikasyon kaynağı içermeleri gerekir. Bu, bakteri kromozomundan bağımsız olarak bakteri hücresinde çoğaltılmalarına izin verir. Transformasyon prosedürü sırasında tüm bakteri hücreleri dönüştürülmez. Böylece dönüşüm, dönüştürülmüş hücrelerin ve dönüşmemiş hücrelerin bir karışımını verir. Bu iki popülasyonu ayırt etmek için, plazmidi edinmiş hücreleri tanımlamak için bir seçim yöntemi kullanılır. Plazmitler genellikle, büyüme için bir avantaj sağlayan bir özelliği kodlayan genler olan seçilebilir belirteçler içerir (yani, bir antibiyotiğe veya kimyasala direnç veya bir büyüme oksotrofisinden kurtarma). Transformasyondan sonra, bakteri hücreleri, yalnızca dönüştürülmüş hücrelerin büyümesine izin veren seçici ortam üzerine kaplanır. Belirli bir antibiyotiğe direnç kazandıran bir plazmit ile transforme olmuş hücreler söz konusu olduğunda, seçici ortam, bu antibiyotiği içeren büyüme ortamı olacaktır. Seçici ortamda yetiştirilen kolonilerin dönüştürücü olduğunu (yani plazmidi dahil ettiğini) doğrulamak için birkaç farklı yöntem kullanılabilir. Örneğin, plazmitler, plazmit hazırlama yöntemleri (10) kullanılarak bu hücrelerden geri kazanılabilir ve plazmit boyutunu doğrulamak için sindirilebilir. Alternatif olarak, ilgilenilen plazmidin varlığını doğrulamak için koloni PCR kullanılabilir (11). 
Bu deneyin amacı, kalsiyum klorür prosedürünün (12) bir adaptasyonunu kullanarak E. coli DH5α kimyasal olarak yetkin hücreleri hazırlamak ve bunları plazmid pUC19 ile dönüştürerek dönüşüm verimliliğini belirlemektir. E. coli suşu DH5α, moleküler biyoloji uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir suştur. Genotipi, özellikle recA1 ve endA1 nedeniyle, bu suş, artan kesici uç stabilitesine izin verir ve sonraki preparatlarda plazmit DNA'nın kalitesini iyileştirir. DNA'nın boyutu arttıkça dönüşüm verimliliği azaldığından, küçük boyutu (2686 bp) nedeniyle bu protokolde plazmid pUC19 kullanılmıştır (vektör haritası için https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html bakınız). pUC19, ampisilin'e direnç kazandırır ve bu nedenle, seçim için kullanılan antibiyotik buydu.

TE birçok faktöre bağlı olmasına rağmen, bunun gibi ticari olmayan yetkin hücre preparatları normalde plazmidin mikrogramı başına 106 ila 107 dönüştürücü verir. Bu nedenle, TE = 2.46 x 108 kob/μg olan bu preparat, beklenen aralığın çok ötesinde bir TE verdi. Belirli bir uygulama için daha yüksek dönüşüm verimlilikleri gerektiğinde süper yetkin hücreler yapmak için ek protokoller mevcuttur (13). 
<p class="jove_content" fo:keep-together...

Uyarlanmış Bir Kalsiyum Klorür Prosedürü Kullanılarak E. coli Hücrelerinin Dönüşümü

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

Bakteriler dikkat çekici bir şekilde uyarlanabilir ve bu adaptasyonu kolaylaştıran bir mekanizma, dış DNA moleküllerini alma yetenekleridir. Bakterilerin alabileceği bir DNA türüne, antibiyotik direnç genleri gibi sıklıkla yararlı bilgiler içeren dairesel bir DNA parçası olan plazmit denir. Bakterilerin harici bir kaynaktan dahil edilen yeni genetik bilgi ile modifiye edilmesi sürecine dönüşüm denir. Transformasyon, Escherichia coli veya E. coli kullanılarak laboratuvarda kolayca gerçekleştirilebilir. E. coli hücrelerinin dönüştürülebilmesi için öncelikle çevrelerinden DNA moleküllerini alabilecek yetkinliğe sahip hale getirilmesi gerekir. Bunu başarmak için protokol şaşırtıcı derecede basittir, hücrelerin bir kalsiyum klorür çözeltisi içinde kısa bir inkübasyonu. Bu inkübasyon, hücrelerin DNA moleküllerine karşı geçirgen hale gelmesine neden olur. Hücreler santrifüjleme ile peletlendikten sonra, süpernatant çıkarılır. Plazmit DNA şimdi yetkili hücrelere eklenir. Hücreler DNA ile inkübe edildikten sonra, karışım kısa bir süre 42 santigrat dereceye kadar ısıtılır, ardından buz üzerinde hızlı bir şekilde soğutulur. Bu ısı şoku, DNA'nın hücrenin duvarı ve zarları boyunca aktarılmasına neden olur. Hücreler daha sonra taze ortamda inkübe edilir. Daha sonra bakteriler, zarlarını yeniden kapatmalarına ve dirençli proteinleri ifade etmelerine izin vermek için 37 dereceye yerleştirilir. Plazmitleri alan hücreler, DNA'yı sadık bir şekilde kopyalayacak ve onu döllerine geçirecek ve antibiyotik direnç aracıları da dahil olmak üzere onun tarafından kodlanabilecek herhangi bir proteini ifade edecektir. Bu direnç genleri, başarılı bir şekilde transforme edilmiş bakterileri tanımlamak için seçilebilir belirteçler olarak kullanılabilir, çünkü plazmidi almayan hücreler direnç geni ürününü ifade etmeyecektir. Bu, hücreler uygun antibiyotik içeren katı bir ortam üzerine kaplandığında, sadece plazmidi alan hücrelerin büyüyeceği anlamına gelir. Büyüyen bir kolonideki hücrelerin dönüşümü, DNA'yı numuneden çıkarmadan önce verimi artırmak için bu hücrelerin gece boyunca sıvı ortamda kültürlenmesiyle daha da doğrulanabilir. DNA izole edildikten sonra, tanısal bir kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirilebilir. Restriksiyon enzimleri DNA'yı öngörülebilir yerlerde kestiğinden, bu sindirimleri bir jel üzerinde çalıştırmak, istenen plazmit başarılı bir şekilde dönüştürüldüyse öngörülebilir bir model göstermelidir. Örneğin, pUC19 restriksiyon enzimi HindIII ile hazırlanır ve kesilirse, jel üzerinde 2686 nükleotidlik tek bir bant görülmelidir. Bu laboratuvarda, E. coli suşu DH-5 Alpha'yı pUC19 ile dönüştürecek ve ardından DNA jel elektroforezi ile başarılı dönüşümü doğrulayacaksınız. Prosedüre başlamadan önce, laboratuvar önlüğü ve eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Ardından, çalışma alanını% 70 etanol ile sterilize edin. Şimdi, steril bir LB agar plakasına bir ilmek dolusu bakteri bırakarak ve bakterileri yeni bir ilmek ile çizerek kimyasal olarak yetkin hücreler hazırlayın. Ardından, plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tezgah üstünü tekrar% 70 etanol ile sterilize edin ve plakayı inkübatörden çıkarın. Tek, iyi izole edilmiş bir koloniyi, steril bir döngüye sahip bir tüpte 3 mililitre LB suyuna aşılayın. Ardından, kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün ve 210 RPM'de çalkalayın. Ertesi gün, gece boyunca kültürün optik yoğunluğunu bir spektrofotometre ile ölçün. Daha sonra, bir litrelik bir şişeye 100 mililitre LB suyu ekleyin ve 0 optik yoğunlukta gece boyunca kültür ile aşılayın. 01. Şimdi, kültürü 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin ve kültür orta üstel büyüme aşamasına ulaşana kadar OD600'ü her 15 ila 20 dakikada bir kontrol edin. Yaklaşık üç saat sonra, 50 mililitre kültürü iki buz gibi soğuk polipropilen şişeye aktarın. Ardından, şişeleri soğuması için 20 dakika tekrar buzun üzerine koyun. Ardından, hücreleri santrifüjleme yoluyla kurtarın. Süpernatanları atın ve şişeleri baş aşağı bir kağıt havlu üzerine koyun. Ardından, bakteri peletini beş mililitre buz gibi soğuk kalsiyum klorür magnezyum klorür çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve pelet tamamen eriyene kadar dikkatlice döndürün. Ardından, çözünmüş bakteri topağına 25 mililitre daha çözelti ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi diğer bakteri peletini yeniden süspanse edin. Bundan sonra, santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanları çıkarın. Yetkili hücreler doğrudan dönüştürülecekse, tüpleri dikkatlice döndürerek her bir bakteri peletini buz gibi soğuk 0.1 molar kalsiyum klorür çözeltisinin iki mililitresinde yeniden süspanse edin. Dönüşüm prosedürüne başlamak için, 50 mikrolitre yetkin hücreyi iki etiketli 1.5 mililitre polipropilen tüpe aktarın. Ardından, tüplerden birine bir mikrolitre pUC19 plazmit DNA'sı ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek hafifçe karıştırın ve her iki tüpü de buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri bir ısı bloğuna aktarın ve 42 santigrat derecede 45 saniye inkübe edin. Tüpleri hemen buza aktarın ve iki dakika inkübe edin. Şimdi, her tüpe 950 mikrolitre SOC ortamı ekleyin ve bakterilerin iyileşmesine izin vermek için 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin ve plazmidde kodlanan antibiyotiğe dirençli belirteçiyi ifade edin. 1 ila 100 seyreltme yapmak için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 990 mikrolitre SOC ortamı ve 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, 1,5 mililitrelik bir tüpe 900 mikrolitre SOC ortamı ve 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek 1 ila 10 seyreltme yapın. Daha sonra, seyreltilmiş hücre süspansiyonlarının 100 mikrolitresini ve negatif kontrolün 100 mikrolitresini bir yayıcı kullanarak ampisilin içeren ayrı seçici plakalara yerleştirin ve plakaları 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, transformasyon yoluyla elde edilen plaka başına koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları sayın ve bu verileri kaydedin. Transformatörlerin pUC19 plazmidine sahip olduğunu doğrulamak için, steril bir döngüye sahip bir plakadan tek, iyi izole edilmiş bir koloni seçin ve bunu 3 mililitre LB suyu içeren bir tüpe verin. Ardından, kültürü gece boyunca çalkalayarak 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre DNA'yı 3 mililitre kültürden izole etmek için bir DNA mini hazırlık kiti kullanın. DNA mini hazırlığını tamamladıktan sonra, 1 mikrogram saflaştırılmış pUC19'u 1 saat boyunca 37 santigrat derecede bir kısıtlama enzimi ile sindirin. Şimdi, 20 mikrolitre moleküler ağırlık merdiveni, 1 mikrogram sindirilmiş plazmit DNA ve 1 mikrogram sindirilmemiş plazmit DNA'yı, mililitre etidyum bromür başına 1 mikrogram içeren% 1'lik bir agaroz jelinin ardışık kuyularına yükleyin. Ardından, jeli 95 voltta 1 saat çalıştırın. Son olarak, jeli bir UV aydınlatıcı ile görselleştirin. Bu deneyde, E. coli DH5 Alfa kimyasal olarak yetkin hücreler, kalsiyum klorür prosedürünün bir adaptasyonu kullanılarak hazırlandı ve daha sonra dönüşüm verimliliğini belirlemek için plazmit pUC19 ile dönüştürüldü. Dönüşüm verimliliğini hesaplamak için, 100'de 1 ve 10'da 1 seyreltme için kaydedilen CFU sayımlarını ve CFU sayıları 30 ile 300 arasında olan diğer seyreltmeler için kullanın. İlk olarak, bu örnekte 246 olan kaydedilen CFU sayısı, burada kaplanan .0001 mikrogram DNA miktarına bölünür. Daha sonra bu sayı, mikrogram başına CFU cinsinden dönüşüm verimliliğini vermek için kullanılan seyreltme faktörüne bölünür. Bu örnekte, 1 ila 10 seyreltme kullanıldı ve 100 mikrolitre 1 mililitrelik bir çözelti kaplandı, bu da 0.01'lik bir nihai seyreltme faktörü verdi. Sindirilmemiş plazmit şeridinde, dairesel DNA, değişen parlaklıkta iki veya üç farklı bant olarak görünebilir. Bunun nedeni, dairesel, kesilmemiş DNA'nın süper sarmal, açık daire veya daha doğrusal gibi birkaç farklı konformasyon durumunda bulunabilmesi ve bunların her birinin jel boyunca farklı oranlarda hareket etmesidir. Geri kazanılan plazmit DNA sindiriminin analizi, kullanılan plazmitin beklenen bir pUC19 DNA boyutuna, 2.686 baz çiftine sahip olduğunu gösterdi.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

İleri Biyoloji

Microbiology

Mikrobiyoloji

calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Bu koleksiyon, uygun steril teknik ve plaklama, selektif ortam kullanımı ve numunelerin güçlendirilmesi ve karışık veya saf numuneler için kültür yöntemleri de dahil olmak üzere mikrobiyolojik araştırmanın temel araçlarını göstermektedir. Ek olarak, mikrobiyal izolatları tanımlamada kullanılan yaygın yöntemlerin yanı sıra bakterilerin genetik manipülasyonu için prosedürleri de içerir.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards