15.14: PCR

Genel bakış

Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA segmentlerini kopyalamak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Üstel amplifikasyon nedeniyle, PCR sadece birkaç saat içinde milyonlarca veya milyarlarca DNA kopyası üretebilir. Bir PCR reaksiyonunda, ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimi, termocycler adı verilen otomatik bir makinenin içindeki bir dizi sıcaklık değişimi ile orijinal DNA'yı çoğaltır.

PCR Moleküler Biyolojide Devrim Yapan Çok Yönlü Bir Yöntemdir

Kary Mullis 1983 yılında PCR'yi geliştirdi ve 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü. Bir DNA dizisini kopyalamanın nispeten hızlı, ucuz ve hassas bir yolu olan PCR, moleküler klonlama, gen mutagenezi, patojen tespiti, gen ekspresyonu analizi, DNA kantitasyonu ve dizilemesi ve genetik hastalık tanısı gibi çok sayıda uygulama için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir.

PCR Reaksiyon Döngüsü

PCR hücrelerde oluşan doğal DNA çoğaltma işlemini taklit eder. Reaksiyon karışımı kopyalanacak bir şablon DNA dizisi, primer adı verilen bir çift kısa DNA molekülü, deoksinükleotid trifosfat (dNTP) adı verilen serbest DNA yapı taşları ve özel bir DNA polimeraz enzimi içerir.

PCR yüksek sıcaklıklarda bir dizi adım içerir ve bu tür sıcaklıklarda işlevsel bir DNA polimeraz enzimi gerektiririr. En sık kullanılan DNA polimeraz Taq polimeraz’dır ve adını ilk olarak izole edildiği Thermus aquaticus bakterisinden alır. DNA polimeraz yöntemi ile bir DNA molekülünü sıfırdan yani de novo şekilde sentezlenemez. Bunun yerine, DNA polimeraz kısa DNA moleküllerini oluşturur, primer denilen tamamlayıcı baz eşleştirme yoluyla DNA şablonuna bağlar. Primerler, DNA polimerazın yeni dNTP'ler takabileceği 3' hidroksil grubu sağlarlar. Bir PCR'de dört tip dNTP vardır ve DNA molekülündeki her nükleotit için bir tanedir: dATP, dCTP, dGTP ve dTTP.

Her PCR döngüsü üç adımdan oluşur: Denatürasyon, Tavlama ve DNA Sentezi.

1. Denatürasyon. PCR döngüsü, reaksiyon karışımının yüksek bir sıcaklığa ısıtılmasıyla başlatılır ve DNA’nın iki iplikçik halinde ayrılmasına neden olur. Bu "erime" işlemi genellikle 90°C-100°C sıcaklıkta gerçekleşir.
2. Tavlama. Reaksiyon karışımı hızlı bir şekilde soğutularak (genellikle 50°C-65°C'ye kadar), iki primerin şablon DNA iplikçiklerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanmasını sağlanır.
3. DNA Sentezi (Primer Uzantısı). Reaksiyon karışımı bu kez tekrar ısıtılır, fakat bu kez DNA polimerazın şablon iplikçikteki bazlarla eşleşen dNTP'ler ekleyerek astarları genişletmesini sağlayan bir sıcaklığa (genellikle 60°C-75°C) kadar ısıtma gerçekleştirilir.

Tipik bir PCR sürecinde termocycler içinde meydana gelen bu üç adım, 20-40 kez tekrarlanır. DNA moleküllerinin sayısı her döngüde iki katına çıktığı için, DNA katlanarak yükseltilir.

PCR’ın Sınırlı Yönleri

Eğer bilim insanı genomun belirli bir bölümünü çoğaltmak istiyorsa, uygun primeri tasarlamak için hedef DNA dizisinin en azından bir kısmını bilmelidir. Bir diğer potansiyel sorun da primerin kısmen benzer DNA dizilerine non-spesifik şekilde tavlanmasıdır. Bu sorun, reaksiyon koşulları optimize edilerek kontrol edilebilir. Son derece hassas bir algılama yöntemi olan PCR, kontaminasyona karşı da savunmasızdır ve DNA'nın eser miktarda kontaminasyonu bile yanıltıcı sonuçlara neden olabilir. PCR'de kullanılan DNA polimerazlar hatalara yatkın olabilir. Eğer ilk birkaç döngü içinde bir mutasyon gerçekleşirse, güçlendirilmiş DNA'nın çoğu bu mutasyonu taşıyacaktır.

- [Eğitici] Polimeraz Zincir Reaksiyonu PCR'nin amacı, genetik bir diziyi çoğaltmaktır. Bu örnekte, ilgilenilen bir gen saflaştırılmış DNA'dan çoğaltılacaktır. Çoğaltmayı gerçekleştirmek için, yeni DNA'yı sentezlemek üzere bir polimeraz gereklidir.

İlgilenilen gen ile aynı homolojiyi paylaşan kısa bir tek zincirli DNA parçası yani bir primer de gereklidir. Son olarak, yeni iplikçik yapmak için Deoksinükleotit Trifosfat veya dNTP adı verilen tekli nükleotidler kullanılır. PCR'nin ilk adımı karışımı ısıtmaktır ve bu DNA'yı denatüre eder.

Daha sonra reaksiyon soğutulur ve primerler kendi homolog bölgelerine tutturulur. Bağlanmadan sonra, reaksiyon polimeraz için en uygun sıcaklığa ısıtılır. Polimeraz daha sonra primer DNA kompleksini tanır ve çözeltideki dNTP'leri kullanarak yeni zincirin sentezine başlar.

Reaksiyon daha sonra ısıtılır ve ilave döngüler boyunca belirtildiği şekilde ilerler. Üçüncü döngüyü takiben, genin toplam sekiz kopyası oluşur. Dördüncü döngüden sonra 16 kopya olur. Ve beşinci döngüden sonra 32 kopya. Kopya sayısı katlanarak artmaya devam eder. 30 döngüden sonra 1 milyardan fazla kopya vardır.