Kolon kromatografisi, bileşikleri, genellikle mikroskobik boncuklar şeklinde olan sabit bir faz ile etkileşimlerine dayalı olarak ayırmak için paketlenmiş bir kolon kullanan bir tekniktir. Boncuklar arasındaki boşluklar çözücü ile doldurulur. Kolonun açılması, çözücünün sabit fazdan akmasına izin verir. Paketlenmiş kolonun tepesine bir karışım uygulandığında ve ardından daha fazla çözücü uygulandığında, karışım mobil faza geçer ve sabit fazdan akar.
Karışımın her bir bileşeni, sabit faz ile farklı bir şekilde etkileşime girer. Bazı bileşenler durağan faz ile zayıf etkileşimlere sahiptir ve bu nedenle kolon boyunca hızlı hareket ederken, diğerleri durağan faz ile güçlü etkileşimlere sahiptir ve bu nedenle daha yavaş hareket eder. Bu, farklı bileşikleri küçük fraksiyonlar halinde toplanan bantlara ayırır. Bu, her bir bileşiğin saflaştırılmasını sağlar.
Peki, karışımları ayırmak için ne tür özellikler kullanılabilir? En sık kullanılan özelliklerden biri polaritedir. Bunun için bir silikon dioksit formu olan silika jel genellikle sabit faz olarak kullanılır. Silika jel, yüzeyinde oluşan -OH grupları aracılığıyla dipol-dipol etkileşimleri ve hidrojen bağı ile bileşiklerle etkileşime girer. Bu nedenle, polar bileşikler durağan faz ile güçlü bir şekilde etkileşime girerken, polar olmayan bileşikler zayıf bir şekilde etkileşime girecektir.
Ayırma için kullanılabilecek diğer özellikler arasında boyut, yük ve hidrofobiklik bulunur. Sabit fazı kolona yüklemenin yaygın bir yolu, sabit faz ve çözücünün bir bulamacıdır. Daha sonra, sabit faz, bulamacı sıkıştırmak için kolondan daha fazla çözücü akıtılarak paketlenir. Sabit fazın hava kabarcıkları, boş kanallar veya kuru lekeler olmadan düzgün bir şekilde paketlenmesi önemlidir. Bunlar akışı bozabilir ve bantların karışmasına neden olabilir.
Bir kolon seçerken, çap ayrılacak numunenin hacmine bağlıdır. Numune, kolonun üst kısmını ince, eşit bir tabaka halinde kaplamalıdır. Daha kalın bir numune tabakası daha geniş bantlara yol açar. Kolon uzunluğu, bileşiklerin sabit fazda ne kadar iyi ayrıldığına bağlıdır. Sabit faz için benzer afiniteye sahip bileşikler, yeterli ayırma için uzun bir kolon gerektirir. Bununla birlikte, durağan faz için çok farklı afinitelere sahip bileşiklerin bir karışımı, daha kısa bir kolon üzerinde ayrılabilir.
Bu laboratuvarda, önce bir silika jel sütunu paketleyip hazırlayarak sütun kromatografisini keşfedeceksiniz. Ardından, yeşil gıda boyasındaki renkli bileşenleri ayırmak için sütununuzu kullanacaksınız.
At the end of this lab, students should know...
Kolon kromatografisi, bir mobil faz ve bir sabit faz içerir.
Bileşikler, durağan faz ile etkileşimlerine göre ayrılır.
Sabit faz ile zayıf etkileşime giren bileşikler, mobil faz ile daha güçlü etkileşime girdikler...
Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.